材料和试剂

1. Stericup 0.22μm过滤器（MilliporeSigma，目录号：SCGVU11RE ）

2. 384w Immulon Maxisorp ELISA 板（ThermoFisher Scientific，目录号：464718）

3. 通用板盖（Fisher Scientific，目录号：5500）

4. 用于 Janus MDT 的 P30 384w 尖端（PerkinElmer，目录号：6001299）

5. 150 mL 自动化储液罐和底座（Integra，目录号：6318）

6. 塑料板密封件（Greiner，目录号：676001）

7. 板框中的0.3 mL Biobank管（Greiner，目录号：9766561）

8. Axygen 96w U 型底板（Axygen，目录号：P-06-450R-CS）

9. 125 µL 低保留 Viaflo 96/384 XYZ GripTips（Integra，目录号：6565）

10. 96w PCR板（Axygen，目录号：PCR-96-FS-C）

11. 96w Immulon 2 HB ELISA 板（ThermoFisher Scientific，目录号：3455）

12. 0.45 µm Stericup（Sigma Millipore，目录号：S2HVU02RE）

13. 125 mL塑料瓶（Corning，目录号：431731）

14. 用于0.3 mL生物样本管（Greiner，目录号：976501）的机架（板框）

15. 125 µL Viaflo 96/384 XYZ GripTips（Integra，目录号：6465）

16. 适用于 SARS-CoV-2 材料的 PPE，包括：及膝一次性实验室外套/长袍，袖子覆盖整个手臂、安全眼镜、鞋套、面罩、一次性袖套和两对丁腈橡胶手套。

17. MBS 毛细管收集管，EDTA-2k，100-150 ul，型号 #CH100ED2K（Micro Blood Science，目录号：001001-BX2）

18. Expi293F ^TM电池（Gibco，目录号：A14527）

19. Expi293 表达培养基（Gibco，目录号：A1435101）

20. HisTrap Excel ^TM柱（Cytiva，目录号：29048586）

21. 蛋白酶抑制剂混合物（Sigma，目录号：P8849）

22. 牛血清白蛋白（BSA）（SeraCare，目录号：1900-0002）

23. Tween-20（Sigma，目录号：P7949）

24. Accurun 810阴性血清（SeraCare，目录号：2010-0020）（储存在4°C）

25. SARS-CoV-2 Spike Antibody，414-1（AM001414）（活性基序，目录号：91361）（等分并储存在-20°C）

26. 抗人 IgG（H+L）-HRP 偶联物（Promega，目录号：W4031）（10 µL 等分试样储存在 -20°C）

27. 正常山羊血清（Jackson Immunoresearch，目录号：005-000-121）

28. 1-Step Turbo TMB-ELISA 底物溶液（ThermoFisher Scientific，目录号：34022）。储存于 4°C。使用前加热至环境温度

29. 硫酸（JT Baker，目录号：9681-2）

30. PFM COVID-19 活性症状、恢复（症状后）和阴性血清是收集和管理的人类血清样本，以支持筛查、诊断和监测研究工作（医学精密，特殊订单）。分装并储存在 -80°C

31. 血液中心样本（对于我们的工作，这是由堪萨斯城社区血液中心友情提供的）

32. 氯化钠（NaCl）（EMD Millipore，目录号：SX0420-5）

33. 氯化钾（KCl）（Calbiochem，目录号：7300）

34. 无水磷酸氢二钠（Na ₂HPO ₄）（JT Baker，目录号：3828-01）

35. 磷酸二氢钾（KH ₂PO ₄）（Macron，目录号：7100-12）

36. 磷酸盐缓冲盐水（PBS，见配方）

37. HisTrap 洗涤缓冲液（参见配方）

38. HisTrap 洗脱缓冲液（参见配方）

39. 4 ×血浆稀释缓冲液（参见配方）

40. 4 ×阻塞缓冲区（见配方）

41. 洗涤缓冲液（见配方）

42. AM1414 (20) 阳性对照库存（见配方）

43. AM1414 (10) 阳性对照库存（见配方）

44. AM1414 (2.5) 阳性对照库存（见配方）

45. 4 × HRP 缓冲液（见配方）

46. HRP 解决方案（见配方）

47. 停止解决方案（参见食谱）

设备

1. AKTA Start（Cytiva，目录号：29022094-ECOMPPGST）或等效的 FPLC 系统

2. Thermo Scientific Orion Star A211 pH 计（ThermoFisher Scientific，目录号：STARA2110）

3. Beckman Coulter Allegra X15X 离心机，带有板载体转子和载体盖（VWR，目录号：BKB09823、BK392806 和 BK393070）

4. 带 3 位工作台和 5-125 µL 的 Viaflo 96 基本单元 96w 头（Integra，目录号：6001、6230 和 6102）

5. Viaflo 96/384 基本单元，带 3 个位置平台和 5-125 µL 96w 头（Integra，目录号：6031、6230 和 6102）

6. LabElite 开盖器/扫描仪（Hamilton，目录号：HST-193601、HST-193620 和 HST-193487）

7. 具有96针头的405 TS垫圈/分配器（Biotek，目录号：405TSUVSQ）

8. ELISA 自动化工作站（参见图 1）包含以下组件，这些组件使用 plate::handler II 机械臂（PerkinElmer，目录号：HH2010100）集成，并由 plate::works 调度软件（PerkinElmer：目录号：HH2010100）控制.

a. 固定板酒店（PerkinElmer，目录号：HH20110091）

b. 自动2 ×吸盘去皮机（PerkinElmer，目录号：HH20110051）

c. G3 Janus 液体处理平台，带有 4 个 PlateStak 和 4 个弹匣和 384w p30 MDT 头（PerkinElmer，目录号 YJSM001 和 PSS00021）

d. EL406 清洗器/分配器，带 192 针头和带 8 通道 10 µL 管的外围泵（Biotek，目录号：406PUB3）

e. 带有 450/10 过滤器组的 Victor Nivo 读板器（PerkinElmer，目录号：HH35000000 和 HH35000919）

软件

1. COVIDtrack 定制样品跟踪软件（将在接受时提供）

2. plate::works 调度软件 (PerkinElmer)

3. Victor Nivo 读板器软件 (PerkinElmer)

4. Janus Winprep 软件 (PerkinElmer)

5. Biotek LHC 清洗软件

6. 微软Excel

7. Graphpad 棱镜 9

8. Miniconda Python 版本 3 ( https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.htmL )

9. 自定义python分析代码： https ://github.com/jayunruh/Jay_Serology

程序

A. 血液采集和血浆制备

1. 研究中的参与者被分配了一个唯一的二维码，用于提交样本。

2. 血液采集套件包括毛细管血液采集容器，上面标有 COVIDTrack 生成的独特一维条码。

3. 参与者在带条形码的毛细管血液采集容器中自行采集了 100-150 µL 的指尖血液样本，并在提交前将其在 4 °C 下储存 <24 小时。

4. 检查提交的样品容器是否有泄漏和所需的最小体积（如毛细管上的标记线所示），然后用乙醇擦拭。

5. 扫描每个样品容器的条形码并将其分配到 Biobank 管和 96 孔位置。

6. 扫描 0.3 mL Biobank 管上的 2D 条码，将血样分配到存储管中，并放置在 Biobank 板框架的匹配孔坐标中。

7. 样品容器在 2,600 × 在将 15-80 μl血浆小心转移到指定的 0.3 mL Biobank 管和 96 孔位置之前，在 4 °C 下在摆桶转子中g 5 分钟。通常，离心后可以从血液样本中收集多达 80 μl的血浆。本协议中描述的半自动样品稀释至少需要 15 μl样品。

8. 扫描 Biobank 板框条形码，并记录孔位置。

9. 一旦所有试管都被扫描并指定为接受或拒绝，扫描的数据将导入 COVIDTrack 以更新样本的位置和状态。样本因采集量低、血液泄漏到采集管的内部容器外或形成血块而被拒绝。

10. 血浆在 4 °C下储存直至进行测定，然后在 -70 °C 下冷冻以长期储存。

11. 为了支持去识别的样本处理，在样本登记导入后，试管 ID 将转换为样本 ID。从 COVIDTrack 下载包括样本 ID 和孔坐标在内的孔板信息，用于分析和数据处理。

视频 1. 血清学检测。

运行检测的机器人工作站的视频。

B. 刺突蛋白的生产和纯化

1. 包含修饰刺突蛋白序列的质粒是 Florian Krammer 实验室（纽约西奈山伊坎医学院）的礼物（Amanat等人，2020）。去除弗林蛋白酶切割位点和添加可切割纯化标签（包括 8 × His）的修改如前所述（Robbiani等人，2020）。

2. 羧基末端带有 10 × His 标签的 qQCXIH 载体中。如 Tsai等人先前所述，使用异位逆转录病毒系统建立了稳定表达的 Expi293F 细胞系。（ 2014 年）。

3. ₂组织培养箱中，在轨道摇床上以 125 rpm 在 Expi293 培养基中悬浮培养细胞。

4. , 000 ×离心获得澄清的上清液 g 15 分钟，然后进行 0.22 μm过滤。

5. 将 pH 调节至 7.4 后，通过 AKTA 启动系统将澄清的上清液上样到 HisTrap ^TMExcel 柱。

6. 用补充有蛋白酶抑制剂混合物的 50 柱体积的 HisTrap 洗涤缓冲液（含有 20 mM 咪唑）洗涤柱。

7. 用 10 柱体积的 HisTrap 洗脱缓冲液（含有 500 mM 咪唑）进行洗脱。收集峰级分作为池。

8. 用 Amicon Ultra 柱将缓冲液换成 PBS，产量为每升培养物 1-2mg。

C. SARS-CoV-2 ELISA 板的制备

1. ELISA 工作站（图 1）用于在 384w ELISA 板上涂上 20 µL SARS-CoV2 Spike 抗原，在 PBS 中稀释至 3-12 和 15-24 列中的最终浓度为 2 µg/mL。使用多通道移液器可以轻松地将抗原手动添加到 384w 板中。

图1。 ELISA 自动化工作站。

(A) 工作站的侧视图和 B) 顶视图，包括 (a) 板式旅馆、(b) 吸盘去胶机、(c) G3 Janus 液体处理器、(d) 清洗机/分配器、(e) Nivo 读板机和(f) 机械臂。

2. 第 1、2、13 和 14 列涂有 BSA，通过向这些孔中添加 20 µL 封闭缓冲液来测试样品对非特异性抗原的反应性。

3. 用塑料板密封板密封板并在 4 °C 下放置过夜。

4. 第二天，从涂层板上取下密封件，将板返回工作站用洗涤缓冲液 (4 × 80 µL) 清洗。

5. 通过在室温下向每个孔中加入 40 µL 封闭溶液 1 小时来封闭与 ELISA 板的非特异性结合，然后用洗涤缓冲液 (4 × 80 µL) 洗涤。

6. 洗涤后，ELISA 板应在 1 小时内使用，以避免抗原涂层过度干燥。

D. 血浆稀释（图3 ）

1. 为了收集管底部的稀释样品，将框架中的生物库管在 1 , 000 × g在室温下使用带有板载体和锁定盖的台式离心机 5 分钟。

2. 在生物安全柜（参见图 2A）中，将 0.3 mL 生物库管中的所有样品（参与者血浆、阳性对照和阴性对照）打开，并使用 Viaflo 在单独的 0.3 mL 生物库管中用血浆稀释缓冲液按 1:5 稀释具有低保留吸头的 96 孔自动化移液器。手动稀释体积小于 20 µL 的试管。

3. 使用开盖器（图 2A）重新盖上试管，然后在室温下短暂离心，以确保在试管底部收集稀释的血浆。

4. 然后将稀释的血浆样品排列到每个 96w 源板框架的第 1 列和第 7 列中。

图 2。 生物安全 引擎盖设置。

A. 样品稀释设置。 B. ELISA 设置。

E. 连续稀释（图3 ）

1. 在生物安全柜（稀释罩，图2A）中，使用在第 1 列和第 7 列上具有低保留吸头的Viaflo 96 移液器将 30 µL 封闭缓冲液分配到第 3、4、5、6、9、10、11 列, 和 12 个 96w PCR 板，在第 2 列和第 8 列中加入 95 µL，作为连续稀释的稀释剂。

2. 1:5 稀释的血浆样品管被打开并用作连续稀释的来源。 Viaflo 96 移液器在第 1 列和第 7 列上配置了低保留吸头，将 5 µL 稀释样品从源板框架添加到 PCR 系列稀释板的第 2 列和第 8 列（最终浓度 1:100），然后缓慢混合（3 × 80 µL ）。

3. 将 30 µL 的 1:100 稀释液从第 2 列和第 8 列转移到第 1 列和第 7 列。重新盖上源管并放在一边，而 Viaflo 96 移液器程序继续生成 5 点 1:4 系列稀释，将 10 µL 稀释样品从第 2 列和第 8 列转移到第 3 列和第 9 列，然后混合 (3 × 30 µL)。

4. 重复该过程，将样品推进一列，直到将 10 µL 体积分配到第 6 列和第 12 列中并混合。

5. 最后，从第 6 列和第 12 列中取出 10 µL 稀释样品并丢弃。该系列的最终稀释浓度为 1:100、1:400、1:1,600、1:6,400 和 1:25,600。图 3D 显示了孔的位置和通过此过程实现的最终稀释。

6. PCR 板盖上盖子并转移到 ELISA 罩（图2B ）。

图 3。 从上到下 (AD) 进行的样品转移和稀释流程图。

在 D 中，连续稀释从左到右进行，如程序 E 所述，并用蓝色染料说明。板上标有孔号，板下方的标签表示该柱中的稀释水平。

F. ELISA 384 孔检测

1. 在生物安全柜中（图2B，ELISA 罩），通过将 17.5 µL 每个样品从 96w 系列稀释 PCR 板转移到一个中，在每个先前包被和封闭的 384w ELISA 板中测定 4-96w 系列稀释 PCR 板中的样品384w ELISA 板的四孔象限（图4），使用带常规吸头的 Viaflo 96/384 自动移液器。

图 4. 向 384 孔 ELISA 板的象限中添加连续稀释的血浆，如蓝色染料所示。

2. 在生物安全柜内，将盖子放在含有稀释样品的 ELISA 板上，并在室温下孵育 20 分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤 (4 × 80 µL)。

3. 洗涤后，将带盖的ELISA板移至ELISA工作站，放置在固定板旅馆中，并执行程序。

4. 简而言之，运行中的每个板以定时顺序循环通过 ELISA 工作流程中的每个步骤（视频 1）。

5. 该过程从将第一个脱层板移至 Janus 平台开始，在每个孔中加入 20 µL HRP 溶液。然后，将板盖上盖子并在板旅馆中在室温下孵育一小时。

6. 将每个板移至洗衣机并用洗涤缓冲液洗涤 (4 × 80 µL)。

7. 为了去除洗涤缓冲液中残留的 Tween-20，使用 peri-pump 将 80 µL 的 PBS 分配到板中，然后使用 peri-pump 将 PBS 从每个孔中取出。

8. 机械臂将盘子从洗衣机转移到 Janus 甲板上，分配 25 µL Turbo TMB-ELISA 底物溶液，然后将盘子放回盘子旅馆，在室温下孵育 30 分钟。

9. Janus 系统将用过的吸头丢弃到吸头盒中，吸头盒向上堆叠到 PlateStak 中；同时将一盒新的吸头向下堆叠以装载到 I30 MDT 头上。

10. 为了开发检测，使用机械臂将板再次移动到 Janus 平台，并将 25 µL 停止溶液分配到每个孔中。

11. 将板转移至 Victor Nivo 读数器，并在 450 nm 处读取每个样品的吸光度。

12. 机械臂将板移至清洗机以去除停止的 HRP 反应溶液，然后将板送回板旅馆进行处置。

G. 化验验证

1. 与 Accurun 810 相比，使用 SARS-CoV-2 单克隆抗体 AM1414 以增加的浓度（2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL 和 20 ng/mL）对 5 点 ELISA 测定进行了测试稀释抗体的阴性血清 (ARN)。

2. AM1414 单克隆抗体显示信号的剂量依赖性增加（图 5A）。

3. 社区中心血液中心阴性血浆（BB26、BB27 和 BB29）在使用 Spike 抗原或 BSA 抗原时几乎没有反应性（图 5B -5 C）。

4. COVID -19 阳性样本显示出比阳性 AM1414 对照显着更高的吸光度值（图5D -5 E）

5. 所有 PFM COVID-19 阴性样品的吸光度均显着低于 AM1414 阳性对照（图5F ），但吸光度值高于血库样品（图5B ）。

6. 除 PFM-R5 和 PFM-N2 外，大多数样品对 BSA 涂层板没有反应（图5G ）。这些样品在稀释测定中分别明确区分为阳性和阴性，表明非特异性反应性不是我们测定的主要限制。

图 5。 Sars-CoV-2 Spike ELISA 测定的验证。

比较 (A) 不同浓度 AM1414 与阴性对照 (ARN) 的滴定曲线，(B) 选择不同的血库样本，(D) 来自活动性感染的 PFM 样本，(E) 来自康复个体的 PFM 样本，以及 (F) PFM来自阴性个体的样本。 (C) 和 (G) 显示对照、血库和 PFM 对照样品的吸光度，与涂有 BSA 的孔结合。

H. 替代 96 孔程序

1. 384w 检测是从最初开发的 96w 检测小型化的。

2. 通过在 Janus 平台上使用 96w I200 MDT 头和 P235 过滤一次性吸头（PerkinElmer；目录号：6001289）和垫圈上的 96 针头，将 ELISA 工作站配置为 96w 测定。

3. 基本的工作流程是一样的；然而，连续稀释、体积和时间是不同的。

4. 此处简要介绍了该协议。 96w Immulon 2 HB ELISA 板（ThermoFisher Scientific，目录号：3455）用封闭缓冲液中的 50 µL Spike 抗原包被。

5. 在加入 100 µL封闭缓冲液之前，用洗涤缓冲液 (3 × 250 µL ) 洗涤涂层，在室温下孵育 1 小时后用洗涤缓冲液洗涤。

6. 如 384w 测定中所述进行 1:5 血浆稀释。

7. µL到第 2 列和第 8 列，以及 12 µL到第 3-6 列和 9-12 列），以低体积进行连续稀释。

8. 将 14 µL 血浆稀释缓冲液加入第 2 列和第 8 列并混合，然后将 12 µL 样品转移到第 1 列和第 7 列。

9. 通过将 4 µL 样品从第 2 列和第 8 列转移到第 3 列和第 9 列，然后混合来进行连续稀释。

10. 重复该过程，移动 4 µL 样品以完成稀释，然后从第 6 列和第 12 列中取出 4 µL 以丢弃。

11. 将总共 108 µL 血浆稀释缓冲液添加到 PCR 板的每个孔中，并将板转移到 ELISA 罩（图 2B）。

12. 将 100 µL 稀释的样品从 PCR 板转移到包被和封闭的 ELISA 板上，在室温下孵育 1 小时，然后洗涤 (3 × 250 µL)。

13. 将 ELISA 板转移到 ELISA 工作站进行与 384w 板相同的工作流程，增加 HRP 溶液 (50 µL)、洗涤缓冲液 (3 × 250 µL)、PBS 冲洗 (250 µL)、Turbo TMB-ELISA 底物 ( 100 µL) 和终止溶液 (100 µL)。

14. 将板转移至 Victor Nivo 读数器，并在 450 nm 处读取每个样品的吸光度。

数据分析

A. 滴定吸光度分析

1. 鉴于在我们的检测中观察到的非特异性反应性（图 5）以及对高通量数据分析的需求，我们开发了定制的 ELISA 分析流程。

2. 使用自定义脚本 ( https://github.com/jayunruh/Jay_Serology ) 在 python 中执行分析。原始吸光度值按稀释浓度组织并适合简单的结合模型： .这相当于希尔系数为 1 的希尔方程。

3. 通过搜索 EC50 值生成最佳拟合，从最低测量浓度的一半开始，到最高测量浓度的五倍结束。搜索是非线性进行的，每一步的值都乘以 1.05。在每个步骤中，通过线性最小二乘法找到 A 和 b 值，并使用搜索中的最小卡方值来确定最佳拟合值。

4. 使用定义如下的曲线下面积(AUC)估计结合：这只是拟合曲线从 0 到最大浓度 ( C _max) 的积分。相对于起始 1/100 稀释度定义浓度。

5. 个体拟合的误差由蒙特卡罗方法确定（Bevington 和 Robinson，2003）。简而言之，将随机高斯数添加到最佳拟合函数中，其标准偏差等于拟合残差的标准偏差，以模拟与原始数据具有相似噪声的数据。然后如上所述拟合这些模拟。误差测量为 50 次模拟的标准偏差。

6. 对于分析的每个板，我们包括三个血库阴性对照和一个 20 ng/mL AM1414 抗体的阳性对照。

7. 我们计算了一个“信号”测量如下：因此，AUC 值与阳性对照相同的样本报告的信号为 20，AUC 值与血库样本相同的样本报告的信号为 0。信号值四舍五入到最接近的整数，低于 0 的值设置为 0。

8. 我们观察到，大多数实验样本包含的背景比血库样本中观察到的背景略多。该背景与我们购买的 PFM 阴性样本相匹配，但我们缺乏用于日常对照的这些样本的数量。因此，我们通过使用血库对照的误差和每天相对于血库样本向上或向下调整的 PFM 样本的平均值来估计阴性对照的统计数据。如果样本与 PFM 平均值不同且P值 <0.01，则称为“非负样本” 。

9. 图 6 显示了来自血库和 PFM 样本的抗体信号，验证了我们的方法。误差线是平均值的标准误差。

图 6。 商业和血库样本的量化证明了测试的准确性。

10. 我们测量的信号指标与 1/EC50 值具有近似对数关系，因此与通常测量的滴度值（图 7）。

图 7。 第一次接种后 20 天内接种过疫苗的初始样本的 EC50 和 AUC 值的比较。

其他积极信号也显示出类似的趋势。虽然我们的方法本身不测量效价（这样的值取决于噪声），但效价约为 EC50 值的 11%，倍稀释度比该图中显示的值高 9 倍。

B. 结果报告

1. Specimen ID 和 Biobank ID 分配了来自分析的测试结论（阳性、非阴性和阴性）和一个信号值。

2. 将数据导入 COVIDTrack 以将结果分配给提交的样本和参与者 ID。

3. 结果和信号值通过机密报告报告给参与者。

4. 数据按收集日期和去标识的参与者 ID 组织，用于下游分析。

数据可用性：商业和去识别血库数据可在https://www.stowers.org/research/publications/libpb-1656获得。志愿者数据可根据书面请求从 Stowers 原始数据存储库中获得。

笔记

1. 参与者血浆没有被热灭活；因此，可能含有一种或多种病原体，应适当处理。

2. 该测定可以用血浆或血清进行。

3. 血浆和血清粘稠；因此，在使用自动化仪器移液时需要缓慢的吸液和分配速度。低保留提示有利于防止血浆或血清粘在塑料上并降低准确性。

4. 溶血样品在测定中表现良好。

5. 血浆或血清样品可以冷冻和解冻至少 3 次，而不会出现明显的信号损失。

6. 血浆或血清 1:5 稀释样品可在 4 ° C 下保存长达三天。

7. 为了 BSL2 安全预防措施，ELISA 板仅在已从生物安全柜中的板中取出稀释血浆后在工作站上进行处理，因为它对室内空气开放。为了在工作站上执行整个 ELISA，仪器需要一个外壳，通过 HEPA 过滤器过滤仪器周围的空气，以消除雾化的可能性。

食谱

1. 1 × PBS

纯水稀释10 × PBS pH 7.4。

使用超纯水将 400 g NaCl 、10 g KCl 、72 g Na ₂HPO ₄和KH ₂PO _{4添加至 4.75 L 制成}10 × PBS。使用 7M HCl 滴加到溶液中调节 pH 值，并使用 Orion Star A211 pH 计测量 pH 值。

2. HisTrap 洗涤缓冲液

20 mM 咪唑溶于 20 mM 磷酸钠和 500 mM 氯化钠，pH 7.4。

3. HisTrap 洗脱缓冲液

500 mM 咪唑溶于 20 mM 磷酸钠和 500 mM 氯化钠，pH 7.4。

4. 4 ×血浆稀释缓冲液

4% BSA 在 4 × PBS pH 7.4 中稀释，用 0.45 µm Stericup无菌过滤并在 4 ° C 下储存在 125 mL 塑料瓶中至少三个月。将 75 mL 蒸馏水加入 25 mL 4 ×储备液中制成1 ×血浆稀释缓冲液，然后在 4 ° C下储存。

5. 4 ×阻塞缓冲区

4% BSA 和 0.2% Tween-20 在 4 × PBS pH 7.4 中，用 0.45 µm Stericup 无菌过滤并在 125 mL 塑料瓶中在 4 ° C 下储存至少三个月。

将 75 mL 蒸馏水加入 25 mL 的 4 ×储备液中制成1 ×封闭缓冲液，然后在 4 ° C下储存。

6. 洗涤缓冲液

0.1% Tween-20 在 1 × PBS pH 7.4 中。

7. AM1414 (20) 阳性对照库存

Accurun 810 阴性血清中将 AM001414 单克隆抗体稀释至 2、000 ng / mL 。制作 25 mL 的等分试样并在 -20 ° C 下冷冻以用于短期储存或在 -80 ° C 下冷冻以用于长期储存。

8. AM1414 (10) 阳性对照库存

中将 AM001414 单克隆抗体稀释至 1 , 000 ng/mL。制作 25 mL 的等分试样并在 -20 ° C 下冷冻以用于短期储存或在 -80 ° C 下冷冻以用于长期储存。

9. AM1414 (2.5) 阳性对照库存

在 Accurun 810 阴性血清中将 AM001414 单克隆抗体稀释至 250 ng/mL 。制作 25 mL 的等分试样并在 -20 ° C 下冷冻以用于短期储存或在 -80 ° C 下冷冻以用于长期储存。

10. 4 × HRP 缓冲液

4% BSA 和 0.4% Tween-20 在 4 × PBS pH 7.4 中。将 75 mL 蒸馏水加入 25 mL 4 ×储备液中制成1 × HRP 缓冲液，然后在 4 ° C下储存。

11. HRP解决方案

含有 5% 正常山羊血清的 1 × HRP 缓冲液中按 1 : 5、000稀释人抗 IgG-HRP 抗体。该溶液应在使用前立即制备。

12. 停止解决方案

用分子级水将浓硫酸稀释至 2 M。

致谢

我们感谢 CZI Biohub 的 John E. Pak 就刺突蛋白表达和纯化提供建议。我们感谢堪萨斯城社区血液中心提供的阴性样本。我们感谢 Florian Krammer 实验室提供的穗表达载体。我们感谢 MIDC 提供用于验证检测但未包含在本出版物中的阳性患者样本。最后，我们感谢为本研究提供帮助的许多 Stowers 研究所成员，特别是 Jennifer Gerton、Brent Kreider 和 David Chao 进行了分析设计讨论，Leanne Weidemann 进行了生物伦理学讨论，以及 Stowers 媒体准备团队为提供本研究的高质量缓冲液。对研究提供帮助的其他人的完整列表在附录中。

贡献： J CF：自动化和分析开发主管； C TS：分析设计和验证； RM、EML、CJB、LEW：分析自动化设计和验证； SS、WBR：刺突蛋白纯化和验证； KJW、BDM、KMD：样本采集和签到设计； JK、AK、AD、JLW：样本跟踪软件开发； LR：研究设计和样本跟踪； TJP：研究设计和样本收集验证； CZ、YW：血清登记处理和验证； JWC：分析设计； JRU：数据分析和测定验证。

因帮助 Stows 抗体研究而获得认可的其他人：

亚当·帕尔默、亚历杭德罗·桑切斯-阿尔瓦拉多、亚历克西斯·默里、爱丽丝·赫利、詹姆斯·萨默斯、安德鲁·博克斯、安德鲁·亨恩、阿诺亚·佩雷拉、布莱克·布莱恩特、布兰登·米勒、布兰迪·刘易斯、布莱恩·斯劳特、辛迪·斯塔伯、康妮·霍耶、丹·布拉德福德、达伦·赖特、大卫·卡尔、丹妮丝·柯林斯、多萝西·斯坦利、艾德·韦斯、加布·基尔、海蒂·奥尔森、雅各布·永克、杰夫·豪格、詹妮弗·约翰逊、耶稣·冈萨雷斯、吉姆·塞尔索、约翰·贝斯特、朱迪·弗耶、朱迪·齐默尔曼、凯莉·史密斯、凯文·费罗、劳里·雷, 莱昂纳多·戈麦斯·德利马, 林赛·伍尔西, 丽莎·拉西斯, 玛德琳·帕尔默, 玛丽亚·卡特, 马歇尔·摩尔, 玛丽·佩妮·梅斯, 玛丽·艾伦·柯克曼, 玛丽莎·布朗, 米歇尔·沃克, 迈克·纽豪斯, 帕齐·汤普森, Pooja Chandra, Preeya Sharma, 朗达·维尔曼, Robb克鲁姆劳夫、罗伯特·厄比、罗恩·康纳威、罗里·芬德、拉塞尔·多里斯、莎拉·拉普、斯科特·麦克罗斯基、斯托尔斯安全团队、赛斯·马洛伊、香农·斯科特、希尔帕·瓦杜瓦瓦拉、斯泰西·沃克、塔玛拉·波塔波娃、塔拉·吉列特、蒂姆·盖瑞、托尼·托雷洛、托尼娅·英格利斯，相映皮。

利益争夺

作者声明与本文的研究、作者身份和/或出版没有潜在的利益冲突。在进行这项研究时，没有公司对研究进行投资，也没有商业化的打算。

伦理

该研究得到了 MRIGlobal 机构审查委员会的批准（注册 IRB00000067）。从所有参与者那里获得了参与研究的书面知情同意书。

参考

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