材料和试剂

1. 6孔透明TC处理的多孔板（Costar，目录号：3516）

2. 12孔透明TC处理的多孔板（Greiner，目录号： 665180）

3. 24孔透明TC处理的多孔板（Corning，目录号：353504）

4. 96孔黑色/透明平底TC处理的带盖成像微孔板（Corning，目录号：353219）

5. 150 mL瓶顶真空过滤器，0.22 µm孔径（Corning ，目录号：431161）

6. 插管、布劳恩、Sterican ^®Gr。 18, G 26 x 1""/ ø 0.45 x 25 mm

7. 细胞培养瓶，550 mL，175 cm ²（Greiner，目录号：660175）

8. 细胞过滤器尼龙网 100 µm（BD Biosciences，目录号：352360）

9. 盖玻片（Merck，目录号：C9802-1PAK）

10. 冷冻管小瓶1.8 mL（Thermo Scientific，目录号：377267PK）

11. 口服管饲针（GLOMED Inc.，目录号：AFN2038S）

12. 砧板或泡沫塑料板

13. 培养皿（Sarstedt，目录号：82.1472.001）

14. 移液器吸头，10 µL（Sarstedt，目录号： 70.1130.600）

15. 移液器吸头，200 µL（Sarstedt，目录号：70.760.502）

16. 移液器吸头，1,000 µL（Heinemann，目录号：PSB）

17. 便携式 Pipet-Aid ^®XP（Drummond，目录号：4-000-201）

18. 血清移液管，堵塞，10 mL（Sarstedt，目录号：86.1254.025）

19. 无菌一次性瓶顶过滤器（Thermo Scientific，目录号：596-4520）

20. 手术刀片（Swann Morton，目录号：0206）

21. 移液管（Sarstedt，目录号：86.1171.010）

22. 管，50 mL（Labsolute，目录号：7696705）

23. 剃须刀片（Fisher Scientific，目录号：12-640）

24. 反应瓶，1.5 mL（Roth，目录号：7080.1）

25. 反应瓶，2 mL（Roth，目录号：7083.1）

26. Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T 细胞（R&D Sytems，目录号：3710-001-01）

27. HEK293T mWnt3a 细胞（由 Robyn Laura Kosinsky 友情提供）

28. HEK293T mNoggin 细胞（由蒂亚戈·德奥利维拉；发表于Farin等人，2012 年）

29. A83-01（Merck Millipore，Sigma-Aldrich，目录号：SML0788）

30. 腺苷5'-三磷酸二钠盐水合物（ATP，Sigma-Aldrich，目录号：A2383-1G）

31. 高级 DMEM/F-12（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：12634010）

32. 偶氮甲烷（AOM，Sigma-Aldrich，目录号：A5486）

33. 葡聚糖硫酸钠（MP Biomedicals，目录号：160110）

34. B-27 ^TM补充（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：17504044）

35. BCA 蛋白质测定（Pierce，目录号：23227）

36. 牛血清白蛋白（Roth，目录号：8076.3）

37. 细胞回收溶液（Corning，目录号：354253）

38. CellTiter-Glo ^®3D 细胞活力测定（Promega，目录号：G9682）

39. CHIR 99021（Axon Medchem，目录号：1386）

40. I型胶原酶（Gibco，目录号：17018）

41. cOmplete ^TMmini 蛋白酶抑制剂混合物（Roche，目录号：11836170001）

42. DMEM，高葡萄糖，GlutaMAX ^TM（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：10566016）

43. DMSO（AppliChem，目录号： A3672,0100）

44. Dual-Glo ^®萤光素酶测定系统（Promega，目录号：E2920）

45. M50 Super 8 × TOPFlash（Addgene，目录号：12456）

46. M51 Super 8 × FOPFlash（TOPFlash 突变体）（Addgene，目录号：12457）

47. pRL-TK 载体（Promega，目录号：E2241）

48. EDTA（Roth，目录号：8040.3）

49. 乙醇（Roth，目录号：8388.3）

50. 胎牛血清（Anprotec，目录号：AC-SM-0190）

51. Geneticin ^TM，G418（InvivoGen，目录号：ant-gn-1）

52. GlutaMAX ^TM补充剂（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：35050061）

53. 山羊抗人 IgG (H+L) 二抗，HRP（Invitrogen，目录号 31410）

54. HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：15630080）

55. Hoechst 33342 Trihydrochloride Trihydrate（Invitrogen，目录号：H3570）

56. 盐酸25％（Merck，目录号：1003122500）

57. 咪唑（Roth，目录号：3899.2）

58. Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate（ECL）（Merck Millipore，目录号：WBKLS0500）

59. L-谷氨酰胺（Gibco，目录号：25030123）

60. Lipofectamine ^TM3000转染试剂（Invitrogen，目录号：L3000015）

61. Matrigel ^®Matrix GFR（Corning，目录号：354230）

62. N-2 补充剂（ Thermo Fisher Scientific ，Gibco，目录号：17502048）

63. N-乙酰基-L-半胱氨酸（Merck Millipore，Sigma-Aldrich，目录号：A9165）

64. 烟酰胺（Merck Millipore，Sigma-Aldrich，目录号：N3376）

65. 硝酸纤维素膜（Merck，目录号：GE10600001）

66. 奶粉（Roth，目录号：T145.4）

67. 正常小鼠 IgG1（Santa Cruz，目录号：SC-3877）

68. InVivoMAb 人 IgG1 同种型对照（bxcell，目录号：BE0297）

69. 过氧化物酶 AffiniPure F（ab'） ₂片段驴抗小鼠 IgG（H+L）（Jackson ImmunoResearch，目录号：715-036-150）

70. 紫杉醇（Sigma-Aldrich，目录号：T7191）

71. PBS片剂（Gibco，目录号：18912014）

72. 青霉素-链霉素（Gibco，目录号：15140122）

73. 碘化丙啶溶液（Sigma-Aldrich，目录号：P4864-10ML）

74. rmEGF（Immunotools，目录号：12343407）

75. ROCK抑制剂Y-27632（Merck Millipore，Sigma-Aldrich，目录号：SCM075）

76. 氯化钠（Roth，目录号：3957.2）

77. 脱氧胆酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：30970）

78. 氟化钠（Applichem，目录号：A0401）

79. 原钒酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S6508）

80. 丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，Gibco，目录号：11360070）

81. Tris-HCl（Roth，目录号：4855.3）

82. Triton ^TMX-100（AppliChem，目录号：A1388）

83. TRIzol ^TM试剂（Invitrogen，目录号：15596026）

84. 胰蛋白酶-EDTA（0.05%）（Gibco，目录号：25300096）

85. TrypLE ^TMExpress 酶（1X）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12604013）

86. Tween ^®20（AppliChem，目录号：A4974）

87. Zeocin ^TM（InvivoGen，目录号：ant-zn-05）

88. TBS-T 缓冲液（见配方）

89. RIPA 缓冲液（见配方）

90. HEK293T Noggin 细胞培养基（见食谱）

91. HEK293T Rspondin-1 细胞培养基（见食谱）

92. HEK293T Wnt3a 细胞培养基（见食谱）

93. 广告⁺媒体（见食谱）

94. 结肠正常和肿瘤类器官培养基（见食谱）

95. 小肠类器官培养基（见食谱）

设备

1. 镊子 (Carl Roth™)

2. 微量移液器 (Eppendorf)

3. 多道移液器 (Eppendorf)

4. 手术剪（Braun，目录号： 64069805）

5. Axiovert 40 CFL 显微镜（Carl Zeiss ^TM，型号：491202-0002-001）

6. Celigo S 成像细胞仪（Nexcelom Bioscience）

7. Centro LB 960 光度计（Berthold Technologies，型号：38100-50）

8. HERAcell 150 培养箱（Heraeus，型号：2854）

9. Megafuge 1.0R 离心机（贺利氏，型号：75003060）

10. Thermomixer Comfort（Eppendorf，型号：5355 000.011）

软件

1. AxioVision 4.8.2（卡尔蔡司显微成像有限公司）

2. Celigo 4 通道软件版本 5.0.0.0 (Nexcelom Bioscience)

3. 斐济或 ImageJ（ http://fiji.sc/或https://imagej.nih.gov/ij/h ）

4. GraphPad Prism 5，版本 5. 04 ( Graphpad Software Inc.)

5. 微软经常 365（微软）

6. MikroWin 2000，版本 4.37 (Mikrotek Laborsysteme GmbH)

程序

第一部分：条件培养基 (CM) 的制备

A. 用 Noggin、Rspondin-1 和 Wnt3a 培养 HEK293T 细胞以调节培养基（图 1 ）

注意：用 mNoggin-Fc、mRspondin-1-Fc 或 mWnt3a 进行基因修饰的 HEK293T 细胞表达感兴趣的蛋白质并将它们分泌到培养基中。这种条件培养基是用于类器官培养的培养基的重要组成部分。

1. 每个 HEK293T 细胞系解冻一等分，转移到 10 mL相应的培养基中，并在 500 下离心 × g 5 分钟。

2. 小心吸出上清液以去除冷冻培养基中存在的 DMSO。

3. 将颗粒重新悬浮在 5 mL 培养基中，并将悬浮液转移到含有 25 mL 生长培养基（总共 30 mL）的 T175 烧瓶中。

4. 在加湿气氛下在 37°C 和 5% CO _{2下孵育细胞。}

5. 当细胞正确附着后（通常在 1-2 天后），如有必要，添加用于选择的抗生素 (sAB)（mNoggin-Fc 细胞 = 500 µg/ mL Geneticin ^TM；mRspo1-Fc 细胞 = 300 µg/ mL Zeocin ^TM; mWnt3a 细胞 = 无 sAB）。

6. 当细胞达到大约 80% 的汇合度时，将所有细胞分成新的烧瓶 (p1)，方法是用 PBS 洗涤并进一步对其进行胰蛋白酶消化，直到细胞从板上分离；稀释细胞并将它们铺板到新的 T175 烧瓶中 (1:3-1:4)。

7. 将 sAB 添加到 mNoggin-Fc 和 mRspo-1-Fc 细胞的所有烧瓶中。

8. 当细胞达到 80% 汇合时，以 1:3 或 1:4 再次分裂细胞进行第 2 代 (p2)。

注意：更高的稀释度也可以获得更多的细胞。

9. 对于条件培养基 (CM)，细胞必须达到100% 融合。

重要提示：不要将 sAB 添加到条件培养基的烧瓶中。

注意：如果需要进一步培养细胞，请仅在这些细胞/烧瓶中添加抗生素。

10. 当细胞达到 100% 融合时，取出培养基并加入 50 mL 的 Ad ⁺培养基（不含选择抗生素）。

11. 经过至少 5 到 7 天的孵化，将相应细胞系的条件培养基 (CM) 通过 0.22 μm 过滤器过滤到无菌瓶和等分中。为防止瓶顶真空过滤器凝结，可将 CM 转移到 50 mL 管中并以 800 ×离心 g过滤前在 4°C 下 3 分钟（沉淀并去除非贴壁细胞）。

12. 将 CM 储存在 -20°C 以供进一步使用，避免冻融。

13. 剩余的培养瓶可用于至少 3-6 代，重复此过程并生成更多条件培养基。

图 1. 一个 HEK293T 细胞系的培养基调节程序的图解说明。 sAB; 选择抗生素。

注意：一些研究人员培养第 2 代 (p2) 仍然用抗生素（用 sAB）直到细胞达到 100% 汇合。重要的是，Ad ⁺培养基必须不含选择性抗生素（NO sAB）。

B. 进行斑点印迹分析，以确定条件培养基 (CM) 中 Rspondin-1 和 Noggin 的数量（图 2 ）

注意：在使用的 HEK293T 细胞中，Noggin 与人 IgG1 Fc 片段融合，Rspondin-1 与鼠 IgG1 Fc 片段融合。进行斑点印迹以检测 Fc 偶联蛋白。

1. 如果需要，为斑点印迹制备相应 IgG 标准的稀释系列。 Rspondin-1 的标准品：正常小鼠 IgG1，Santa Cruz，目录号：SC-3877。 Noggin 标准品： InVivoMAb 人 IgG1 同种型对照，bxcell，目录号：BE0297。

标准行的推荐稀释度（IgG Stock 0.2 mg/mL）：从 0.2 到 0.025 mg /mL，在 5% BSA 的 TBS-T （0.1% Tween ^®20）中。

2. 解冻每一个等分的条件 Noggin 和 Rspondin-1 培养基并准备稀释系列。在 TBS-T中用5% BSA稀释：未稀释 – 1:2 – 1:4 – 1:8 – 1:16。

3. 通过切割大约 7 × 9 厘米大小的印迹制备两个硝酸纤维素膜，该印迹可在 50 mL 管中孵育。用铅笔画线，以指示将应用斑点的位置。

4. 在相应的膜上点 2 µL 样品或标准品。通过非常缓慢地应用溶液/点来最小化该区域。发现所有样品、标准品和阴性对照。

5. 将取样的硝酸纤维素膜转移到盒子或培养皿中，盖上盖子，让膜干燥（几个小时或过夜）。

6. 将每个膜转移到 50 mL 管中。

7. 通过在滚子上在 RT 上将膜在封闭溶液（TBS-T 中的 5% 牛奶）中孵育 30-60 分钟来封闭非特异性位点。

8. 去除封闭溶液并与 HRP 偶联的二抗 [抗人 HRP (mNoggin-Fc) 或抗小鼠 HRP (mRspo1-Fc)，在封闭溶液中均为 1:10,000] 在 RT 上在滚筒上孵育 30 分钟。

9. 用 TBS-T 清洗 3 次，每次在滚筒上至少清洗 10 分钟。

10. 利用西方化学发光 HRP 底物以产生信号（通常会获得非常强的信号）。

图 2. Rspondin-1 和 Noggin条件培养基的代表性斑点印迹。

斑点印迹分析用于估计条件培养基 (CM)中 Rspondin-1 (Rspo1) ( A ) 和 Noggin ( B ) 的量。点样未稀释 (undil.) 和稀释的 CM，为了定量，将各自的标准点样在每个膜上。 Rspo1 标准 1：正常小鼠 IgG1，Santa Cruz，材料 #71。 Noggin 标准 2：人 Fc 片段， InVivoMAb 人 IgG1 同种型对照，材料 #72。无条件 Ad ⁺培养基用作空白。

注意：标准也可用作浓度系列，以更好地量化 (B) 中的量。

C. 进行 TopFlash 测定，以确定 Wnt3a 条件培养基 (CM) 的活性（图 3 ）

笔记：

1) TOPFlash检测可以使用可转染良好的细胞系，如H1299细胞。

2) Wnt3a 未与 Fc 片段融合，因此无法对 Noggin 和 Rspondin-1 进行斑点印迹分析。因此，进行 TopFlash 测定以评估产生的 Wnt3a 的活性。

1. 培养良好的可转染细胞系。

2. 将种子细胞放入 2 mL 培养基中的 6 孔板中。

3. 根据制造商的指南，使用 Lipofectamine ^{TM 3000 用 500 ng TOP/200 ng Renilla 或 500 ng FOP/200 ng Renilla 质粒转染细胞。}

4. 细胞与转染试剂孵育 24 小时后，取出培养基并加入 2 mL 的条件 Wnt3a 培养基。在 37°C 下孵育至少 16 小时。

5. 与 Wnt3a CM 一起孵育后，根据制造商的指南，使用 Dual-Glo ^®萤光素酶检测系统进行萤光素酶检测。

图 3. TopFlash 检测的代表性结果。

条件培养基 (CM) 用于 TopFlash 测定，以估计培养基中 Wnt3a 的活性。因此，用 TOP 或 FOP 质粒转染细胞并与 CM Wnt3a 一起孵育。无条件 Ad ⁺培养基用作空白对照。

第二部分：从一只供体小鼠中制备小鼠配对类器官

注意：结肠配对类器官制备是指从同一受体产生肿瘤来源和正常上皮来源的类器官。如前所述（Tanaka 等人，2003；Becker 等人，2005；Klemke 等人，2021），使用化学品偶氮甲烷 (AOM) 和葡聚糖硫酸钠 (DSS) 诱导小鼠结肠直肠肿瘤 。

类器官的制备

A. 小鼠肠上皮细胞和肿瘤的分离

笔记：

1 )为了最大限度地降低污染风险，在开始之前对所有使用过的工具进行消毒或灭菌。

2 )为了最佳地降低污染风险，PBS 可以补充抗真菌药物，例如两性霉素，抗生素，例如青霉素/链霉素，或联合药物溶液，例如抗生素-抗真菌剂（例如，来自 Thermo Fisher）。

3 )当使用一瓶新鲜的 Matrigel ^®时，可以在冰上 4°C 缓慢解冻过夜，然后分装到 1.5 mL 或 2 mL 管中。使用前，将 Matrigel ^®等分试样在冰上解冻至少一小时。

4 ) Matrigel ^®应始终保持在冰上。在生物安全罩下处理 Matrigel ^®有多种可能的方法。为了达到最佳无菌状态，可使用可消毒的凝胶填充冷却袋或冷却架进行冷却。装满冰块的可消毒桶或盒子更容易处理，但会带来更高的污染风险。

5 ) Matrigel ^®在使用前通常可以在冷培养基中稀释至15-20%，具体取决于Matrigel ^®批次的蛋白质浓度和硬度。应注意批次差异（蛋白质浓度应高于 9 mg/ mL ，内毒素水平应低于 1.5 EU/ mL ）。

6 )板可以预热以促进 Matrigel ^®固化。

1. 根据当地法规和相应的动物实验应用，使用适当的方法对小鼠进行安乐死和准备。

2. 完全取出肠道或单独取出任何肠段。

注意：这些步骤中的最佳无菌状态可最大限度地降低培养中的污染风险。为了便于操作，请使用针头或套管将仰卧位的鼠标连接到可消毒的切菜板或泡沫塑料板上。在用剪刀打开皮肤之前对毛皮进行消毒。为了达到最佳无菌状态，小心地将皮肤与腹壁分开，以防止腹膜穿孔。使用新鲜剪刀，打开腹膜腔。

3. 用镊子取出肠系膜，将肠道切成更小更易于处理的部分（例如，大致相当于培养皿的直径）。将肠道部分放入冷 PBS 中，标记为小肠和大肠（结肠）。

4. 用冷 PBS 轻轻冲洗肠道部位，例如，使用啮齿动物管饲针。

5. 将肠道部分放在培养皿盖上，纵向打开每个肠道部分，管腔表面向上。

6. 对于结肠的肿瘤制备，解剖几个肿瘤，将它们转移到冰冷的 PBS 中，并将它们切成小块。

7. 对于正常的小肠和结肠上皮细胞制备，用盖玻片非常轻轻地刮掉肠道中多余的粘液或残留粪便。

8. 从肠道中切出正常的肠道碎片。小心并避免解剖带有肿瘤上皮组织的部分。将肠道碎片切成大约2 mm × 2 mm 的小块。（例如，纵向切割一次，然后横向切割，使用剃须刀片引导和手术刀切割。）

9. 将碎片转移到装有大约 15 mL 冷 PBS 的 50 mL 管中。从现在开始，永远在冰上工作。

10. 洗涤：

a. 正常小肠：

i. 彻底清洗。使用预湿的 10 mL 血清移液器上下移液（大约 30 次）。此步骤对于去除粘附在粘膜上的肠道菌群至关重要。为了提高制备产量，可以推荐使用 FCS 对移液器进行预涂层。

ii. 让碎片通过重力沉降并轻轻吸出上清液。

iii. 添加 15 mL 的冷 PBS 并重复冲洗程序。

iv. 重复这些洗涤步骤 ( i - iii ) 10 次。在这个过程结束时，上清液应该几乎是透明的。由于小肠中有大量粘液，因此必须正确执行清洗步骤。

b. 正常结肠：

i. 适度洗涤。使用预湿转移移液器上下移液（大约 10 次）。此步骤对于去除粘附在粘膜上的肠道菌群至关重要。为了提高制备产量，可以推荐使用 FCS 对移液器进行预涂层。

ii. 让碎片通过重力沉降并轻轻吸出上清液。

iii. 添加 15 mL 的冷 PBS 并重复冲洗程序。

iv. 重复这些洗涤步骤 ( i - iii ) 3-5 次。在这个过程结束时，上清液应该几乎是透明的。

c. 结肠肿瘤：

i. 彻底清洗。使用预湿转移移液器上下移液（大约 10 次）。此步骤对于去除粘附在粘膜上的肠道菌群至关重要。为了提高制备产量，可以推荐使用 FCS 对移液器进行预涂层。

ii. 让碎片通过重力沉降并轻轻吸出上清液。

iii. 添加 15 mL 的冷 PBS 并重复冲洗程序。

iv. 重复这些洗涤步骤 ( i - iii ) 5-7 次。在这个过程结束时，上清液应该几乎是透明的。

注意：洗涤步骤的数量可能因人而异，但无论如何，当上清液几乎清澈时可以终止洗涤。

11. 隐窝和肿瘤细胞分离

a. 正常小肠：

i. 吸出上清液。用大约 15 mL 的 5 mM EDTA 溶液平衡，去除上清液，加入 15 mL 新鲜的 EDTA 溶液，并在 4°C 的台式滚筒上孵育 30 分钟。

注意：在孵育过程中，通过移液器将少许液滴移到干净的培养皿或显微镜载玻片上，在相差显微镜下检查，检查上清液中是否有可见的隐窝，这有助于优化此步骤的孵育时间。

ii. 在无菌细胞培养罩下准备 50 mL 管，添加细胞过滤器（100 μm 孔径），用 10 mL 的 PBS 冲洗过滤器来平衡过滤器，然后让 PBS 留在管中。

iii. EDTA 孵育 30 分钟后，使用无菌血清移液器上下移液六次。让碎片通过重力沉降，并将上清液作为第一部分吸出。

注意：在这些步骤中快速工作可减少 EDTA 介导的对孤立隐窝的毒性。使用相差显微镜检查特征隐窝。根据分数中存在的隐窝数量，第一部分可以丢弃或通过细胞过滤器过滤到含有冰冷 PBS 的 50 mL 管中，以直接稀释 EDTA 溶液。

iv. 将 10 mL 的冰冷 PBS 添加到肠道碎片中，上下移液几次，使用显微镜检查隐窝，并重复过滤到每个分数的 50 mL 管中。重复直到管子被填满或直到足够的隐窝被隔离。

b. 正常结肠：

i. 吸出上清液。用大约 10 mL 的 4 mM EDTA 溶液平衡，去除上清液，加入 5 mL 新鲜的 4 mM EDTA 溶液，然后在 4°C 的台式滚筒上孵育 30 分钟。

笔记：

1) 对于结肠隐窝，我们使用 4 mM EDTA 在可行且隔离良好的隐窝中实现了适当的产量。然而，对于小肠隐窝，需要 5 mM EDTA 才能在我们手中进行适当的隐窝隔离。 EDTA 的浓度甚至可能增加到 10 mM，这取决于分离的隐窝的产量（Lukovac 和 Roeselers，2015） 。所需的 EDTA 浓度可能不仅取决于肠道的各个部分，还取决于机械破坏的强度。

2) 在孵育过程中，通过移液器将少许液滴移到干净的培养皿或显微镜载玻片上，在相差显微镜下检查，检查上清液中可见的隐窝，这有助于优化此步骤的孵育时间。

ii. 在无菌细胞培养罩下准备 50 mL 管，添加细胞过滤器（100 μm 孔径），并通过用 10 mL 的 PBS 冲洗过滤器来平衡过滤器。

iii. EDTA 孵育 30 分钟后，用力上下移液器（约 10 次），并检查上清液中第一部分的隐窝数。通常，来自 EDTA 溶液上清液的第一部分中结肠隐窝的数量非常少，因此可以丢弃上清液。然而，如果 EDTA 上清液中存在许多隐窝，则可以使用第一部分。

iv. 将 10 mL 的冷 PBS 添加到肠道碎片中，用力上下吸管（大约 10-20 次），让碎片通过重力沉降，并将上清液作为新部分吸出。在显微镜下检查隐窝编号。如果存在适当数量的隐窝，则通过细胞培养罩下的细胞过滤器过滤到含有 10 mL 冷 PBS 的新鲜 50 mL 管中。

v. 重复步骤 iv 直到管子被填满或直到足够的隐窝被隔离。如果可以从碎片中分离出更多的隐窝，请使用新的 50 mL 管。

c. 结肠肿瘤：

i. 吸出上清液。

ii. ^{+培养基中}加入 2 mL 的 2 mg/ mL胶原酶 I 型溶液，在 37°C 下孵育 20-30 分钟。每 10-15 分钟上下吸管一次组织片，使用移液管促进细胞分离。

iii. 孵育 30 分钟后，加入 10 mL 的 PBS，并用力上下移液，直到几乎没有更大的肿瘤块留下。

iv. 通过细胞过滤器将悬浮液过滤到新的 50 mL 管中。

12. 从现在开始在无菌条件下工作。

13. 在任何情况下，如有必要，可在试管中加入多达 50 mL 的冰冷 PBS。

14. ×离心管 g在 4°C 下 3 分钟。

15. 小心吸出上清液。

16. 添加 10 mL 的冷 Ad ⁺培养基并小心悬浮颗粒。

17. 再次以 500 ×离心管 g在 4°C 下 5 分钟。小心吸出完整的上清液并将试管置于冰上。

B. 播种

注意：每个 Matrigel ^{®的体积 [µL]} dome 是常规培养的近似值或建议值，可根据具体实验需要进行调整（表 1）。

表 1 。使用推荐的 Matrigel ^{®和培养基体积的}细胞悬液，适用于不同的板格式。

笔记：

1) 为了最大限度地降低污染风险，在开始之前对所有使用过的工具进行消毒或灭菌。

2) 为了最大限度地降低污染风险，所有类器官培养基都可以额外添加抗真菌药物，如两性霉素，或抗真菌/抗菌药物组合溶液，如抗生素-抗真菌药（例如，来自 Thermo Fisher）。

3) Matrigel ^®应始终保存在冰上或以其他方式冷却。为尽量减少 Matrigel ^®损失，移液器吸头可预冷至 -20°C。向颗粒中加入适量的 Matrigel ^®（表 1）并轻轻混合，直至颗粒完全分散。避免在 Matrigel ^®中产生气泡。

4) 通常，在制备一只小鼠后，分离足够的隐窝和肿瘤细胞，在隐窝6孔板中培养1-2孔，在6孔板中培养肿瘤细胞2-3孔。

1. 在预热的 6 孔板中每孔加入 200 µL 细胞悬液（一孔 8 滴 25 µL）。孔的数量取决于分离产量以及所需的体积和细胞密度。

2. 在 37°C 下孵育大约 30 分钟，直到 Matrigel ^®固化。

3. 每孔加入 2 mL 预热的类器官培养基，在 37°C 和 5% CO _{2的加湿气氛下培养}。

4. 每 2-3 天更换一次培养基。

5. 根据您的实验需要培养和治疗。

注意：请记住，Matrigel ^®可能会保留处理溶液。圆顶中的培养基和处理痕迹不容易被冲走。因此，必须彻底清洗处理：吸出上清液后，用预热的 PBS 进行初始清洗步骤。加入培养基并在 37°C 下孵育至少 30 分钟。然后，再次更换培养基。第二天再次更换培养基，进一步减少处理痕迹。

在 96 孔板中播种的特殊注意事项：

1. 准备96 孔平底培养板，方法是用 PBS 预填充外排孔并在 37°C 的培养箱中预热培养板。

2. 很好地分配有机体悬浮液（从 50 mL 管传代时，轻轻摇动就足够了）。

3. 继续播种。每口井种子 10 μL 的有机体悬浮液。小心地将液滴播种到井的中心，不要接触井壁。对于初学者，可以通过在孔底部敲击装载的移液器一次而不弹出以在播种前进行深度定向，从而提高精度。

注意：更多的体积会增加可用于实验的有机体的数量，但也会增加液滴粘附在井壁上的风险，然后必须将其排除在分析之外。

4. 孔重复步骤 2 和 3，在每个播种孔后分配悬浮液，以防止播种密度不均。

5. 小心地将板转移到培养箱中 30 分钟以固化^Matrigel®。

6. 每口井添加 100 μL 培养基（建议使用多通道移液器）。

7. 根据您的实验需要培养和治疗。

注意s ：对于 96 孔格式的上清液的抽吸，可以推荐以下方法：

1) 使用真空泵的最低功率设置。

2) 如果吸力仍然损坏 Matrigel ^®圆顶，可以通过堆叠塑料移液器吸头进一步降低功率。

C. 传代

注意：对于小肠类器官培养，建议在大约 4-7 天后拆分，对于结肠和肿瘤类器官培养，建议在 6-8 天后拆分，拆分比例为 1:2 或 1:3，具体取决于播种密度和关于播种前的物理破坏。

1. 小心地从井中吸出培养基。

2. 通过向每个孔中加入冰冷的 PBS 来溶解 Matrigel ^{® domes。}

3. 将悬浮液转移到含有 5-10 mL 冷 PBS 的 50 mL 管中。如果仍有 Matrigel ^®和类器官，请再次用冰冷的 PBS 冲洗孔。

4. 添加多达 50 mL 的冰冷 PBS。

5. 500 ×离心管 g在 4°C 下 5 分钟。

6. 小心吸出上清液。

7. 加入 3 mL 的冰冷 PBS，上下大力吸管 20 次。对于较长的分裂间隔或较小的碎片，用 1 mL 移液器上下移液 40 次。为了以最小的破坏获得最佳的机械破坏，将蓝色移液器吸头对角放置在管底部的一侧，而不是直接放在中心。或者，连接到 5 mL 血清移液器上的 200 μL 移液器尖端可用于机械分离。

笔记：

1) 为提高 Matrigel ^®的去除效果，建议在第 6 步之后在 2 mL 细胞回收溶液中冰上孵育 10 分钟。在 4°C 下以 500 × g 离心管 5 分钟并吸出上清液。

2) 如果在第 7 步后类器官碎片仍然太大，也可以通过在 4 mM EDTA 溶液（用于结肠）和 5 mM EDTA（用于小肠）中孵育，在 4°C 的滚筒上孵育 30 分钟，然后进行额外的机械解离。中断。

8. 添加多达 50 mL 的冰冷 PBS。

9. 500 ×离心管 g在 4°C 下 5 分钟。

10. 小心吸出上清液并将试管置于冰上。

11. 添加 10 mL 的冷 Ad ⁺培养基并小心悬浮颗粒。

12. 再次以 500 ×离心管 g在 4 C 下 5 分钟。小心吸出完整的上清液，将装有细胞沉淀的试管放在冰上。

13. 按照 B 节中的说明继续播种。

注意：为验证正常结肠来源的类器官没有被肿瘤来源的类器官污染，可以在没有Wnt t3a 条件培养基的相关类器官培养基中平行播种一口正常结肠类器官并培养。肿瘤类器官可以在没有 Wnt3a 的情况下生长，而正常的结肠类器官则不能，这是一种功能控制。此外，正常结肠衍生的类器官在形态上与肿瘤衍生的类器官不同。从图形摘要中可以看出，正常结肠衍生的类器官（绿色）显示出较厚的隐窝状上皮层，而肿瘤衍生的类器官（红色）是圆形的，具有薄的上皮层。

数据分析

A. 从类器官中分离蛋白质和 RNA

蛋白质分离

笔记：

1) 为了有足够的蛋白质进行免疫印迹分析，将类器官接种在 6 孔板中。

2)为防止样品降解，在样品在 RIPA 缓冲液中裂解之前，可以将蛋白酶和磷酸酶抑制剂添加到所有溶液中。

1. 将板放在冰上并吸出培养基。

2. 加入 1 mL 冰冷的 PB S（用于 6 孔格式），并在孔中缓慢上下移液以小心破坏 Matrigel ^®圆顶。

3. 在冰上转移到 5 mL 管中，并用冰冷的 PBS 填充至 5 mL。

4. ×离心管 g在 4°C 下 3 分钟。

5. 小心去除上清液。

6. 根据剩余的 Matrigel ^®量（沉淀顶部的混浊相），将 200-300 µL 冰冷的细胞回收溶液 (CRS) 添加到沉淀中。

7. 在冰上的 CRS 中孵育 10-15 分钟。

8. 添加多达 5 mL 的冷 PBS。

9. ×离心管 g在 4°C 下 3 分钟。

10. 小心去除尽可能多的上清液。如果仍有 Matrigel ^®存在，重复 CRS 孵育步骤（步骤6-10 ）。

11. 在颗粒中加入 80 μL 的 RIPA 缓冲液。将悬浮液悬浮并转移到 1.5 mL 管中。

12. 根据制造商的指南使用 BCA 蛋白质测定法测量蛋白质浓度，以确保蛋白质含量相等以进行进一步的免疫印迹实验，和/或在 -80°C 冷冻以供进一步使用。

注意：或者，可以跳过第一个 PBS 洗涤和离心步骤，并且可以使用冷 CRS 从板中直接收获类器官。这增加了产量，但需要使用更大体积的 CRS，因为类器官应在冰上与每孔约 1 mL CRS (200 µL Matrigel ^®) 一起孵育 10-15 分钟。然后，继续 PBS 稀释和离心（步骤 8）。

RNA分离

对于定量实时聚合酶链反应 (qRT-PCR)，在 12 孔板中播种有机体时的 RNA 量通常就足够了。

1. 可以使用 RNA 分离的两种方法：

a. 直接从孔中分离 RNA：

i. 吸出培养基并用预热的 PBS 清洗一次。吸出 PBS 溶液。

ii. 将 1 mL 的 TRIzol ^TM直接添加到孔中并孵育 10 分钟。

iii. 小心地将样品上下移液几次以使溶液均匀。

iv. 将悬浮液转移到 1.5 mL 管中。

b. 去除 Matrigel ^{®后的 RNA 分离}

该过程类似于蛋白质分离描述的协议（蛋白质分离部分）。

i. 吸出培养基并用预热的 PBS 清洗一次。吸出 PBS 溶液。

ii. 将盘子放在冰上，向每个孔中加入冰冷的 PBS。通过上下移液破坏 Matrigel ^®圆顶。

iii. 转移到 5 mL 管中，并用冰冷的 PBS 填充至 5 mL。

iv. 1,000 ×离心机 g在 4°C 下 3 分钟。

v. 尽可能多地去除上清液。

vi. 如果残留 Matrigel ^®（颗粒顶部的混浊物质），向颗粒中加入 200-300 µL CRS (Corning)，并在冰上孵育 10-15 分钟。

vii. 用冰冷的 PBS 填充高达 5 mL。

viii. 1,000 ×离心机 g在 4°C 下 3 分钟。

ix. 去除上清液并将 1 mL TRIzol ^TM试剂添加到颗粒中。

x. 在将悬浮液转移到 1.5 mL 管中之前孵育 10 分钟。

2. 根据制造商的指南在 TRIzol ^{TM试剂中分离 RNA。}

^®的任何引物特异性干扰。直接从孔中分离 RNA 可能具有更高产量和快速停止生物过程的优势，但是，一些引物可能会干扰 Matrigel ^®的成分。

B. 有机体形态和活力的量化

1. 明场图像的形态学量化

形态量化可以根据 Grabinger等人的修改描述来确定。（2014 年）。

然而，对于非球形生长形态，例如显示出芽生长结构的小肠类器官，这可能不是那么容易适应，我们还推荐其他测定，如下所述。

注：根据形态，类器官可细分为三组（图 4 ）：

1)健康（绿色箭头）：形态正常，类器官管腔内几乎没有死细胞堆积。

2)受压（黄色箭头）：管腔内中度至大量死细胞堆积，外层上皮屏障仍完好无损。

3)死亡（红色箭头）：类器官部分或完全破坏成死细胞团块，外上皮屏障丧失。

健康和压力大的类器官可以被认为是有生命的，因此可以总结为一组。

图 4.结肠肿瘤类器官的形态学量化。

将结肠肿瘤类器官接种在 6 孔板中，并用 HSP90 抑制剂（右）或 DMSO 对照（左）处理 24 小时。在形态学上，所有成像的类器官都被细分为健康（绿色箭头）、压力（黄色箭头）或死亡（红色箭头）。使用 ImageJ 的“细胞计数器”功能计算每组类器官的数量。比例尺，200 µm。

a. 根据实验设置培养或处理类器官后，通过光学显微镜拍摄图像。通常，使用 4 倍放大倍率，每个凝胶圆顶拍摄一张图像。

图像的总量取决于凝胶圆顶的大小和数量。

b. 使用 ImageJ 的“细胞计数器”功能评估每组有机体的数量。

c. 计算每个子组相对于每张图像计数的有机体总量的百分比。

d. 形态学量化后，类器官可进一步用于蛋白质或 RNA 分离（A 部分）。

注：本部分的详细数据处理和分析以及统计计算（B. 类器官形态的量化）在相应的开放获取文章 Klemke 等人中提供。（2021 年）。

2. 染色细胞活力，使用碘化丙啶和 Hoechst 33342 双重染色进行可视化（图 5 ）。

PI 是一种红色荧光 DNA 嵌入染料，它不会渗透未固定的活细胞，因此在这种情况下只染色死细胞。 Hoechst 33342 是一种细胞永久性 DNA 嵌入核试剂，用作细胞核的复染剂，可以对类器官进行形态学检查。因此，双重染色可用于可视化类器官中的活细胞和死细胞（Jabs等人，2017）（图 5）。

a. 按照 B. 播种和 C. 传代到 96 孔板中所述进行传代和播种，并根据您的实验需要进行培养和处理。为获得最佳效果，请使用黑色/透明平底 96 孔板。

b. 将碘化丙啶添加到最终浓度为 1 µg/ mL和 Hoechst 33342 到最终浓度为 10 µg/ mL到培养基中。（为了降低荧光背景，可以使用不含酚红的培养基。）

c. 在 37°C 下孵育 35 分钟。（较短的孵育时间可能会阻止溶液到达 Matrigel ^®圆顶的内部，较长的孵育时间可能会增加毒性。）

d. 使用读板器、荧光显微镜或自动成像系统（如 Celigo Image Cytometer (Nexcelom)）进行成像。

图 5。 小肠类器官的碘化丙啶/Hoechst 33342 荧光染色的示例性数据。

接种后两天，用 DMSO（左）和 1 mM 紫杉醇（右）处理小鼠小肠类器官 24 小时，然后更换培养基。冲洗 4 天后，根据方案将类器官与碘化丙啶和 Hoechst 33342 一起孵育，并在 Celigo Image Cytometer 中成像。比例尺：1,000 µm。

3. 使用 CellTiter-Glo ^®3D进行细胞活力测定

注意： CellTiter-Glo ^®3D 的制造商建议使用白色不透明孔。然而，这些板不允许对有机体进行显微镜观察，因此可能无法检测到不均匀的播种密度。可以在我们推荐的 96 孔透明平底培养板中进行 CellTiter-Glo ^{® 3D。}CellTiter-Glo ^®3D 协议源自制造商的指南。

a. ATP 标准曲线（图6 ）。

注意：为细胞活力测定执行 ATP 标准曲线是一种良好的科学实践，并排除所有不是源自该标准曲线的线性部分或源自显着不同的板或不同的实验条件的实验数据。

i. 在 PBS 中稀释一系列 ATP 浓度。可以推荐大约 50 nM 到 500 µM 的范围（见图6）。

ii. 每孔加入 100 µL ATP 溶液，然后加入 100 µL CellTiter-Glo ^®3D 溶液，继续进行与实验相同的孵育和测量步骤。

图6 。 _ CellTiter-Glo® 3D 测定的 ATP 标准曲线。

将 PBS 中指定浓度的 ATP 溶液在室温下孵育 45 分钟，并使用 CellTiter-Glo ^®3D 测定法测量发光。 n = 3 个技术板内重复的平均值 ± SEM。

b. CellTiter-Glo ® ^3D检测（图7 ）

i. 按照 B. 播种和 C. 传代到 96 孔板中所述进行传代和播种，并根据您的实验需要进行培养和处理。

注意：必须实现有机体的相同播种密度（另请参阅在 96 孔板中播种的特殊注意事项）。对于初学者来说，这可能会很困难。因此，我们建议在治疗前对所有孔进行成像，以确保在任何实验开始时有机体密度相等。

ii. 让 CellTiter-Glo ^®3D 试剂溶液平衡至室温。

iii. 将每孔 100 µL CellTiter-Glo ^®3D 试剂直接加入培养基中。

iv. 在室温下在 450 rpm 的摇床上孵育至少 30 分钟。（较高的摇动速度可能会从孔中弹出溶液。在第一次实验之前，在 96 孔板中用水测试正确的速度。）

v. 用读板器测量发光信号。当有机体粘在井壁上时，将其排除在分析之外，因为它会干扰信号强度。

图 7。 肠道类器官的 CellTiter-Glo ^®3D 测定结果的示例性数据。

以指定浓度的紫杉醇或对照 (DMSO) 处理以 5 个技术板内重复 (n = 5) 为种子的小鼠小肠类器官 24 小时。冲洗四天后，在 PI/Hoechst 处理后测量发光，使用 CellTiter-Glo ^®3D 测定并标准化为对照（也参见步骤 B4）。数据表示为平均值±平均值的标准误差 (SEM)。使用未配对的双尾学生t检验确定组之间的差异。 *** P < 0.001，与对照相比。

4. 结合 PI/Hoechst 染色和CellTiter-Glo ^®3D细胞活力测定

可以将 PI/Hoechst 染色的良好可视化和形态表征的优势与使用 CellTiter-Glo ^®3D 测定法准确量化细胞活力的优势相结合，通过连续执行它们而不会对细胞活力产生相关影响（图8 ).我们建议使用黑色/透明平底 96 孔板。

a. 让 CellTiter-Glo ^®3D 试剂溶液平衡至室温。

b. 执行步骤 B2。

c. 吸出上清液。

d. 每口井添加 100 μL 的预热 PBS。

e. 执行步骤 B3b.iii。

图 8。 碘化丙啶/Hoechst 33342 (PI/Hoechst) 染色对细胞活力没有影响。

小鼠小肠类器官培养3天，进行步骤B4 。未染色 (-) 和 PI/Hoechst 染色 (+) 类器官的比较，根据协议“ 2. 使用碘化丙啶和 Hoechst 33342 染色双重染色进行细胞活力可视化的细胞渗透性染色”。在 PI/Hoechst 处理后测量发光，并使用 CellTiter-Glo ^3D测定（步骤 B3b）获取图像。六个技术板内重复的平均值 (n = 6) ± SEM。

C. 统计量化

对于步骤 B1（数据分析部分），建议在每个独立实验的每个条件下拍摄至少三个 Matrigel 圆顶的图像。所需图像的数量取决于大小和培养密度。死亡类器官的百分比是相对于每张图像的类器官总量计算的。

B2和 B3（数据分析部分），建议至少执行三个独立的生物复制。为了减少播种差异对结果的影响，建议至少执行三个板内技术复制。可以使用 GraphPad Prism 软件对数据进行分析和图形说明。实验数据可以标准化为对照处理的类器官的平均值。与对照治疗相比，组之间的差异可以通过未配对的双尾学生 t 检验来确定。对于更复杂的统计检验，建议进行多重检验校正和其他统计分析方法。

食谱

1. TBS-T 缓冲液

高压灭菌的 MilliQ 水

50 毫米三

150 毫米氯化钠

调节至 pH 7.5 (HCl)

0.1% 吐温^® 20

2. RIPA 缓冲液

高压灭菌的 MilliQ 水

1% 脱氧胆酸钠

10 毫米乙二胺四乙酸

1% 海卫^TMX-100

0.1% SDS

150 毫米氯化钠

20 mM Tris-HCl pH 7.5

完整^{的 TM}迷你蛋白酶抑制剂混合物

由 2 mM 咪唑、1 mM 原钒酸钠和 1 mM 氟化钠组成的磷酸酶抑制剂混合物

3. HEK293T Noggin 细胞培养基

DMEM（材料和试剂 #42）补充：

10% FCS

1 mM 丙酮酸钠

15,000 单位/L 青霉素/15,000 µg/L 链霉素

选择抗生素，sAB：500 µg/ mL Geneticin ^TM

4. HEK293T Rspondin-1 细胞培养基

DMEM（材料和试剂 #42）补充：

10% FCS

1 mM 丙酮酸钠

15,000 单位/L 青霉素/15,000 µg/L 链霉素

选择抗生素，sAB：300 µg/ mL Zeocin ^TM

5. HEK293T Wnt3a 细胞培养基

DMEM（材料和试剂 #42）补充：

10% FCS

1 mM 丙酮酸钠

15,000 单位/L 青霉素/15,000 µg/L 链霉素

无选择抗生素（无 sAB）

6. 广告⁺媒体

高级 DMEM-F12 辅以：

1 × GlutaMAX ^TM补充剂

10 毫米 HEPES

15,000 单位/ L青霉素/15,000 µg/ L链霉素

7. 结肠正常和肿瘤类器官培养基

广告⁺媒体补充：

50% 厘米 Wnt3a

20% 厘米头

10% CM Rspondin-1

1 × N-2, 1 × B-27 ^TM

3.4 μg/mL ROCK 抑制剂

5 μM CHIR 99021

500纳米 A83-01

10 毫米烟酰胺

80 µM N-乙酰-L-半胱氨酸

200 纳克/毫升 rmEGF

注意：p1 后，ROCK 抑制剂仍然需要在分裂后立即添加，但可以在分裂后第 2 天的下一次培养基更换时从培养基中去除。

8. 小肠类器官培养基

广告⁺媒体补充：

20% 厘米头

10% CM Rspondin-1

1 × N-2, 1 × B-27 ^TM

80 µM N-乙酰-L-半胱氨酸

50 纳克/毫升 rmEGF

致谢

RS-H。和 LK 得到德国研究基金会 (DFG) (SCHUH-3160/3-1) 的支持。 JPB 得到了哥廷根医学生博士学院（Else Kröner 基因组动力学和表观基因组学博士学院）和德国国家学术基金会的奖学金支持。 TDO 得到哥廷根大学研究资助计划 2020 (K-1403640) 的支持。我们感谢 Tamara Isermann（哥廷根分子肿瘤学）的技术援助和 Robyn Laura Kosinsky（哥廷根普通内脏和儿科外科诊所）提供 HEK293T mWnt3a 细胞。

发表在开放获取期刊上的原始研究论文是 Klemke L、De Oliveira T、Witt D、Winkler N、Bohnenberger H、Bucala R、Conradi LC、Schulz-Heddergott R。Hsp90 稳定的 MIF 支持结直肠癌中通过巨噬细胞募集和血管生成的肿瘤进展。细胞死亡Dis。 2 月 4 日；12(2):155。 2021 年（PMID：33542244）。

利益争夺

作者声明没有相互竞争的利益。

伦理

小鼠实验得到了国家（Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit，LAVES，德国）和机构（哥廷根大学医学中心）委员会的批准，确保所有实验符合相关监管标准。在无病原体屏障条件下饲养和处理小鼠。

参考

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