材料和试剂

1. 高级显微镜载玻片磨砂（Fisherfinest，目录号：12-544-2）

2. 康宁 24 × 50 mm 矩形盖板玻璃（Fisher Scientific，目录号：12-553-464）

3. 6孔板（康宁，目录号：07-200-83）

4. 塑料袋（Uline，目录号：S-952）

5. U2OS 细胞 (ATCC)

6. DMEM（Gibco，目录号：11965-092）

7. FBS（Gibco，目录号：A4766801）

8. 大鼠单克隆抗 BrdU（Abcam，目录号：ab6326，储存于 -20°C）

9. 小鼠抗 BrdU（Becton Dickinson，目录号：347580 B44，储存于 4°C）

10. 山羊抗大鼠 IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 594（Invitrogen，目录号：A-11007，4°C，避光）

11. 山羊抗小鼠 IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488（Invitrogen，目录号：A32723，4°C，避光）

12. 不含 DAPI 的 Prolong Gold（Invitrogen，目录号：P36930，RT）

13. HBSS（Gibco，目录号：14175-095）

14. BRCA2 siRNA（Dharmacon，目录号：L-003462-00-0005，溶解在20μM的无核酸酶水中）

15. 非靶向 siRNA（siNT Qiagen，目录号：1027281）

16. Dharmafect 1（Dharmacon，目录号：T-2001，在 4°C 下储存）

17. Opti-MEM（Gibco，目录号：31985-070）

18. EDTA 0.5M pH 8.0（Corning，目录号：46-034-CI，RT）

19. SDS 10%（Sigma，目录号：75746-250G；溶于水，室温保存1年）

20. Tris-HCl pH7.4 1 M（Sigma，目录号：77-86-1；溶于水，用HCl调节pH至7.4，室温保存1年）

21. Triton X-100（Sigma，目录号：T8787）

22. 冰醋酸（Fisher，目录号：A38-212）

23. 甲醇（Fisher Scientific，目录号：A413-20）

24. 盐酸（Fisher Scientific，目录号：A144-212）

25. 山羊血清（Gibco，目录号：16210072，在 -20°C 下分装到 1ml ependoff 管中）

26. 胰蛋白酶（Gibco，目录号：25200056）

27. IdU（Sigma，目录号：I7125，-20°C 下的粉末，以 50 mg/ml 或 141.2 mM 的浓度重悬于 1 N 氢氧化铵中；等分至 20 μl，在 -20°C 下储存长达 3 年）（参见食谱）

28. CldU（Sigma，目录号：C6891，-20°C 下的粉末，以 20 mg/ml 或 76.1 mM 重悬于 1 N 氢氧化铵中，在 -20°C 下储存长达 3 年）（参见配方）

29. 羟基脲（HU；Sigma，目录号：H8627）（参见配方）

30. 纤维铺展缓冲液（见配方）

31. 变性缓冲液（见配方）

32. 阻塞缓冲区（见食谱）

设备

1. 撒布器（见图3制作方法）

2. 免疫荧光显微镜（尼康，型号：Ti-DH）

3. 科普林罐

4. 培养箱或水浴

软件

1. 尼康 Nis 元素 BR 4.40.00 64 位

2. 棱镜 8

3. 电子表格

程序

A. 细胞制备

将 BRCA2 siRNA 转染到 6 孔板中的 U2OS 细胞：

1. 在 6 孔板的每孔中加入 150,000 个 U2OS 细胞，加入 2 ml 完全培养基。准备 4 口井：两口用于控制 siRNA，两口用于 BRCA2 击倒。

2. 对于每个孔，在 250 μl Opti-MEM 中制备 2 μl 20 μM siRNA。在单独的管中，在 250 μl Opti-MEM 中加入 4 μl Dharmafect 1，涡旋并等待 5 分钟。然后，将 Dharmafect 1 溶液添加到 siRNA 溶液中，涡旋并在 RT 中孵育 15 分钟。

3. 将转染混合物涂在细胞上并摇匀。

4. 在 37°C 培养箱中孵育细胞 48 小时。标记前 1 天更换为新鲜培养基。

B. 细胞标记

1. 标记前一天，在培养箱或 37°C 水浴中加热 20 ml 完全培养基和 50 ml HBSS。

2. 收获一口对照 siRNA 和一口 BRCA2 敲低，以运行蛋白质印迹以测试 BRCA2 表达（此处不包括蛋白质印迹协议）。

3. 在温暖的完全培养基中制备 20 μM CldU、100 μM IdU 和 4 mM HU，每个体积为 5 ml。在水浴或培养箱中加热标记介质直至使用。

4. 倒出 6 孔板中的旧培养基，向细胞中加入 2 ml CldU 培养基，然后将细胞放回培养箱中 20 分钟（图 3）。

图 3. 标签示意图

5. 用温热的 HBSS 缓冲液冲洗细胞 3 次（每次冲洗 2 毫升）。总共执行洗涤步骤至少 2 分钟，不要太快，因为这可以减少绿色/红色信号重叠。

6. 加入 2 ml Iof dU 培养基，将细胞放回培养箱中 20 分钟（确保浓度恰好为 100 µM，否则控制比例可能会发生变化）。

7. 用平衡的 HBSS 洗孔 3 次至少 2 分钟，然后加入 HU 培养基，将细胞放回培养箱中 5 小时。

C. 传播

1. 在室温下对细胞进行胰蛋白酶消化 5 分钟（6 孔板为 300 µl/孔）。

2. 使用 ~700 µl 培养基悬浮细胞并转移到 Eppendorf 管中。计算细胞数。以 500 × g离心细胞3 分钟。

3. 在冰冷的 PBS 中吸出并重悬细胞，以获得大约 1 × 10 ⁶^个细胞/ml。

4. 将载玻片平放在设备上，白色磨砂端朝上。每个装置都有 4 张幻灯片 (图 4A-4B)。

a. 只能用铅笔在标签上滑动，因为记号笔会在固定步骤中被冲走。

b. 标记已添加细胞的载玻片，以便稍后可以轻松找到纤维。

c. 通常，每个样品铺 2 张幻灯片，染色 1 张幻灯片并保留另一个备用。如果染色良好，一张载玻片可以包含 100-200 根双色纤维。如果纤维不够自信，你应该染色 2 张或更多的幻灯片。

图 4.自制的纤维铺展装置。

(A) 将 6 孔板的盖子水平朝上，提起 200 μl 在盖子旁边的小费盒，然后将它们粘在一起。6 孔板盖最多可同时容纳 4 个载玻片。(B) 添加裂解缓冲液后，向下翻转盖子，载玻片的一侧将抬起约 15°。该角度赋予合适的铺展率。

5. 将 2 µl 细胞悬液（施加 1,000-2,000 个细胞）添加到靠近白色磨砂端的载玻片中。在添加到幻灯片之前轻弹管以重新悬浮细胞。让它风干约 5-6 分钟，直到样品变得发粘（图 4A、5A-5B）。

注意：将样品以 0.7 厘米长的水平线铺在载玻片上（而不是放置一滴）。这有助于在成像时“扩散”细胞以获得较少重叠的 DNA。

6. 在载玻片上的细胞中加入 10 µl 涂抹缓冲液（图 5C）（使用新鲜的涂抹缓冲液，这可以显着改善结果）。在室温下放置 6 分钟以裂解细胞。

7. 将幻灯片倾斜 15°，让 DNA 沿着幻灯片缓慢运行（图 4B 和 5D）。

笔记：

a. 确保下降直线且缓慢地运行。

b. 不要让液滴在顶部停留太久，因为 DNA 会缠结成一个球。

图 5. 在载玻片上铺展的细胞和 DNA。

(A) 取 2 μl 细胞悬液，在载玻片的指定区域画一条 7 mm 的线。(B) 等待 5-6 分钟，让悬浮液干燥到一半，直到您可以看到如图所示的扩散区域中的点。如下图所示，不要完全干燥细胞。(C) 滴入 10 μl 裂解缓冲液以覆盖所有细胞铺展线。(D) 抬起装置以激活 DNA 扩散。虚线区域预计包含大部分优质纤维。

8. 在室温下风干至少 30 分钟。

9. 在引擎盖的 Coplin 罐中的固定缓冲液中固定 5-10 分钟。

10. 倒出固定缓冲液，取出载玻片，在尿布罩上的空气干燥载玻片至少 20 分钟。

11. 将载玻片在 -20°C 下至少保存一天至最多 3 天。

注意：PBS 中的额外细胞可以在 4°C 下保存少于 6 天。

D. 染色

1. 在 Coplin 罐中用变性缓冲液处理幻灯片 70 分钟（图 6A）。

2. 用 Coplin 罐中的 PBS 冲洗 3 次，冲洗载玻片的两侧。

3. 将载玻片平铺在预先切好的塑料袋中，DNA 铺展面朝上，每张载玻片加入 100 μl 封闭缓冲液，然后用塑料袋的另一半盖住载玻片。在室温下孵育1 小时。（图 6B-6E）。

注意：无菌过滤血清以减少背景染色。

图 6. 纤维染色。

(A) 变性或洗涤 Coplin 罐中的载玻片。(B) 预切塑料袋的两侧。(C) 将幻灯片平铺在袋子上。(D) 滴下封闭缓冲液或抗体，然后覆盖另一半塑料膜，避免气泡。(E) 在阴影区域所示的位置滴下封闭缓冲液和抗体。

4. 将大鼠单克隆抗 BrdU（抗 CldU ab6326）和小鼠抗 BrdU（抗 IdU BD347580）在封闭缓冲液中稀释 1/100，例如，1 μl 大鼠抗 BrdU 和 1 μl 小鼠抗 BrdU 在 98 μl 封闭缓冲液。将 100 μl 稀释的一抗应用于每张载玻片（图 6D-6E），按照封闭步骤用塑料膜覆盖载玻片，并在室温下孵育 2 小时。

笔记：

a. 确保不存在气泡。将水滴放在白色磨砂端，轻轻放置，让水滴在载玻片上扩散。

b. 所有孵育都在黑暗中进行，因此最简单的方法是将载玻片放在抽屉中。

5. 在 Coplin 罐中用 PBS 冲洗 3 次。

6. 在封闭缓冲液中以 1:350 稀释山羊抗大鼠 IgG Alexa Fluor 594 和山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488。每张幻灯片应用 100 µl（图 6D-6E）。在新的预切袋中在黑暗中孵育 1 小时。

7. 在 Coplin 罐中用 PBS 冲洗 3 次。

8. 在黑暗中风干约 10-15 分钟。

9. 使用整个载玻片盖玻片安装 ~35 µl Prolong Gold，不含 DAPI。

笔记：

a. 将盖玻片与载玻片的白色边缘对齐。

b. 尽量减少气泡。

10. 在黑暗中干燥过夜，您的载玻片就准备好了。

笔记：

a. 在角落涂上指甲油，以便立即查看。

b. 载玻片在室温下干燥过夜后，将其放入 4°C 的载玻片盒中以保存信号直至准备查看。建议尽快或在一周内可视化幻灯片。

E. 成像

1. 在绿色或红色通道（IdU 为绿色，CldU 为红色）下寻找光纤。

2. 对于本协议中的尼康显微镜，使用油切换到 40 倍，将焦点数转为大约 2,050，这应该在纤维层的焦点周围。

3. 纤维将与背景斑点在同一平面上。

4. 将目标与放置单元格的幻灯片区域对齐 (图 5D)。

5. 缓慢进行，因为光纤的焦点区域非常小并且很容易通过。

6. 大多数纤维在朝向磨砂端的载玻片部分被检测到。

7. 仅捕获在红色和绿色之间具有明确边界的单个纤维。

数据分析

1. 光纤测量（图 7）

a. 单击右侧的“2 点”按钮，如图 7A 所示，箭头将转到测量模式（图 7A）。

b. 单击红色光纤的开头（图 7B），然后单击红色光纤的末端以完成红色光纤长度测量事件（图 7C）。测量的纤维长度出现在表中（图 7D）。

c. 对绿色纤维重复测量。一次完整的光纤测量应包含红色和绿色。

d. 仅测量笔直且不与其他轨道重叠的光纤。

e. 始终先测量红色光纤，然后测量与已测量红色光纤相连的绿色光纤。

f. 始终测量具有双色染色且没有长间隙的纤维，以确保它们属于一个复制事件。

g. 始终测量具有起点和终点的单根光纤。

h. 始终测量您有信心的纤维。

i. 为了获得可重复的结果，通常需要 200 根光纤。单击“导出”将数据复制到 Excel（图 7E）。

图 7. 纤维测量。

单击 (A) 中所示的两点按钮，然后单击 (B) 和 (C) 继续测量红色纤维，以生成 (D) 所示的红色纤维长度数据。始终先测量红色纤维，然后测量绿色纤维。单击“导出”，如 (E) 所示，将纤维长度导出到 Excel。

2. 数据分析

a. 将纤维长度数据导出到 Excel，从 D 开始删除列（图 8）。

图 8. 将纤维长度数据粘贴到 Excel。

b. 第一根光纤的光纤长度编号顺序应该是红绿色，下一根光纤的光纤长度编号顺序应该是红绿色，依此类推。

c. 对于 NSD 测定，我们计算 Length _green/Length _red的比率。因此，使用第 2 行的函数“=C3/C2”将第一个光纤（红色）长度数除以第二个光纤（绿色）长度，然后将划分扩展到数据集的最后一行（图 9）。

图 9. 如图所示将第一个红色光纤长度除以第一个绿色光纤长度，然后将单元向下延伸到末端。

d. 要整理出奇数行中每根光纤的 IdU/CldU 比率，请使用 E 列第 2 行的函数“=IF(MOD(ROW(),2)=0,1,0)”来标记我们需要的数据，然后扩展到数据集的最后一行（图 10）。

图 10. 用函数“ =IF(MOD(ROW(),2)=0,1,0)”标记感兴趣的数据，向下延伸到最后。

e. 因为我们需要每根光纤的 IdU/CldU 的比率，而不是下一根光纤的 CldU 与最后一根光纤的 IdU 的商，所以我们需要对我们需要的数据行进行排序，在 E 列应用排序函数，然后选择标记为 1 的行对商进行排序（图 11）。

图 11. 按过滤器对数据进行排序，如图所示。

f. 将每个样品的每个纤维的商复制到 Prism 8。

3. 使用 Prism 8 绘制数据

a. 打开 Prism 8，点击左侧菜单栏。选择如图 12A 所示的选项。

b. 在表格的第一行输入样品名称。对照样品是“siNT”，BRCA2 敲低样品是“siBRCA2”。然后粘贴 Excel 文件中的数据点（图 12B）。

c. 单击左侧的“Graphs”按钮，然后选择如图所示的选项。双击图中的数据点，然后选择如图 12C 所示的选项。

图 12. 将 IdU/CldU 比率数据从 Excel 复制到 Prism 8。

(A) 创建一个如图所示的新表单。(B) 将数据粘贴到列中，然后单击左侧图表选项卡中的数据 1。弹出图形类型选项 (C) 后，单击“确定”。

d. 单击“确定”，获取图形，然后根据需要修改图形（图 13）。

图 13. 装饰图形。

在没有 BRCA2 的情况下，IdU/CldU 的比率小于 1，表明新生 DNA 被降解，与之前的研究一致。

4. 统计数据

在 Prism 8 中执行统计。详情请参见：https : //www.graphpad.com/guides/prism/latest/statistics/index.htm。

笔记

对于其他应用中使用的标签协议，请参见图 2A。分析数据见下图：

1. 货叉速度。出于叉速目的，请绘制 CldU 或 IdU 光纤长度而不是比率。

2. 叉重启。计算双色纤维（重启纤维）和纯红色纤维（停滞纤维），然后计算双色纤维数与总计数纤维的比率。

3. 叉反转。仅适用于 NSD 因前叉反转失活而获救时的极限条件。测量与 NSD 测定相同，绘制 IdU/CldU 的比率.

4. ssDNA 缺口检测。对于 S1 核酸酶处理，请参阅 Bai等人的详细信息。(2020)。测量值是纤维长度。

食谱

1. 吸毒者

IdU 以 50 mg/ml 或 141.2 mM 重悬于 1 N 氢氧化铵中，并在 -20°C 下储存长达 3 年。

2. 氯化铀

CldU 以 20 mg/ml 或 76.1 mM 重悬于 1 N 氢氧化铵中，并在 -20°C 下储存长达 3 年。

对于以下试剂，使用前新鲜配制：

1. 胡

76.08 mg 羟基脲溶于 1 ml 水中，得到 1 M HU 溶液。为了获得最佳性能，每次都使用新鲜的。

2. 光纤扩展缓冲器

0.5% SDS

200 mM Tris-HCl pH 7.4（使用前检查 Tris 的 pH）

50 mM EDTA

溶于 ddH ₂O

使用前准备新鲜

3. 固定缓冲液

3：1甲醇：醋酸，每次使用前都要新鲜。

4. 变性缓冲液

用水将浓盐酸 (~14 M) 稀释至 2.5 M。每次使用前都要新鲜。

5. 阻塞缓冲区

10% 山羊血清溶于 PBSTw（0.1% Triton in PBS），每次使用前都要新鲜。

致谢

资金：这项研究得到了 NIH (R01GM116616) 和乳腺癌研究基金会对 DC 的资助。感谢 Liu等人使用的原始协议。（2020 年；DOI：10.1126/sciadv.abc3598）来自 Cortez 实验室。

利益争夺

没有宣布竞争利益。

参考

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