材料和试剂

1. Eppendorf 管（1.5ml 和 2ml，Thermo Fisher Scientific，目录号：509-GRD-Q 和 508-GRD-Q）

2. 0.22 μm Millex-GP 注射器过滤器（默克，目录号：SLGPR33RB）

3. 96 孔板（200 μl，Round Bottom，Beyotime，目录号：FPT016）

4. 纸巾

5. 移液器吸头（Thermo Fisher Scientific QSP，目录号：112NXL-Q）

6. 1 ml无针注射器（LABSTAR，目录号：BX150）

7. 拟南芥种质 Col-0、fec （Gimenez-Ibanez等，2009）和rps2 （Mindrinos等，1994）

注：拟南芥 Col-0 植物含有 RPS2 基因，该基因介导效应蛋白 AvrRpt2 的识别并诱导植物 ETI 对 Pst DC3000(avrRpt2) 的抗性。fls2 efr cerk1 ( fec )三重突变体，在三个主要模式识别受体基因中发生突变；rps2 突变体在 RPS2 基因中发生突变，编码识别 AvRpt2 的受体。

8. 丁香假单胞菌光伏。番茄 (Pst) DC3000 和Pst DC3000( avrRpt2 )（Mudgett等，1999）

9. 次氯酸钠（国药化学试剂，目录号：80010428）

10. 无菌水（例如，Milli-Q）

11. 混合土，包含基质（PINDSTRUP）、蛭石（尺寸：1-3 mm）和珍珠岩（尺寸：3-5 mm），这些材料在混合土壤中的比例为3:9:1。

12. 胰蛋白胨（OXOID，目录号：LP0042B）

13. 酵母提取物粉（OXOID，目录号：LP0021B）

14. 磷酸二氢钾（KH ₂PO ₄）（国药化学试剂，目录号：10017608）

15. 氯化钠（NaCl）（国药集团化学试剂，目录号：10019318）

16. 硫酸镁（MgSO ₄）（国药集团化学试剂，目录号：20025117）

17. 琼脂粉（上海鼎国生物，目录号：DH010-1.1）

18. 利福平（Yeasen Biotechnology，目录号：60234ES08）

19. 壮观霉素（Sangon Biotech，目录号：A600901-0005）

20. 75%乙醇（国药化学试剂，目录号：80176965）

21. Luria-Marine (LM) 固体培养基（见配方）

22. 利福平原液（50 g/L，1,000×）（见配方）

23. 壮观霉素原液（50 g/L，1,000×）（见配方）

设备

1. 超低温冷冻机（-75°C冷冻机，New Brunswick Scientific）

2. 托盘（尺寸：310 g）、透明塑料圆顶、锅（尺寸：8 cm）和网（孔径：网 18 = 880 μm）

3. 拟南芥生长室（Percival 和 JIUPU）

4. 移液器（1 ml，Rainin，型号：L-1000PL 出口）

5. 离心机（Eppendorf，型号：5425R ）

6. 分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop ONE ^C）

7. 钢球（直径 5 mm；SSCB，目录号：KH000268 ）

8. Millex-GP 注射器过滤器单元（默克，目录号：SLGPR33RB）

9. 相机（佳能，型号：EOS 80D）

10. Vortex Oscillator（科学工业，型号：Vortex-Genie 2）

11. 镊

12. 烧杯（Thermo Scientific，目录号：1201-1234 ）

13. 软木钻孔器（Sigma-Aldrich，目录号： Z165220-1SET，直径7.5 mm）

14. TissueLyser（上海精信实业，型号：Tissuelyser-48）

15. 立体镜（徕卡，型号：MDG41）

16. 高压釜

17. 温湿度数据记录器（Easylog，型号：EL-21CFR-2-LCD）

软件

1. 微软Excel

2. GraphPad棱镜8

程序

A. 在土壤中种植拟南芥植物

1. 拟南芥种子用5%次氯酸钠灭菌7-10分钟，然后用灭菌水冲洗种子5次；将消毒后的种子在4 °C的黑暗中放置两天。

注意：冷处理会同步发芽。

2. 将混合好的土壤放入超低温冰箱（-20°C 以下）中过夜。

注意：高压灭菌土壤通常对我们手中的种子发芽和植物生长有害。因此，我们使用冷冻处理来杀死土壤中的昆虫卵和幼虫，以防止植物生长过程中的昆虫侵扰，而不会对种子萌发造成任何明显影响。

3. 将土壤放入小塑料盆中，用网盖住盆，并用橡皮筋固定网（图 1A）。

4. 用移液管在土壤中播种消毒种子（来自 A1，约 200-300 粒种子/ml）（每盆约 20-30 粒种子，每个角 4-8 粒种子）。

5. 在60％，温度生长的植物在环境受控生长室，与相对湿度设定在22℃，在100μE光强度⋅米^-2⋅小号^-1具有12小时光照/ 12小时黑暗的光周期。

6. 一周后去除多余的幼苗，每盆保留4个幼苗。

7. 每 2-3 天用自来水给植物浇水。我们的实验使用了四到五周大的植物（图 1B）。

图 1. 细菌感染和过敏反应检测的实验程序。

A. 在盆中准备混合土壤。B.在环境控制的生长室中生长的 4 周龄拟南芥植物的外观。C. 使用 1 ml 无针注射器用细菌溶液接种叶子。D. 接种的植物用圆顶盖住以保持高湿度，以便病害在温室中发展。E. 浸润后 3 天的接种叶照片。F.渗入 Col-0 植物 3 天后的疾病表型，白色虚线框代表选定的代表性样品。G. 对采样的叶子进行消毒和冲洗。H.使用软木钻孔器（直径 7.5 毫米）对叶盘进行采样。I. 地叶溶液。J. 将提取液以不同的稀释比例稀释，然后从每个稀释液中取 10 μl 置于 LM 琼脂平板上。K. 用立体镜计算菌落数。L. 用于 HR 测定的组织塌陷表型的照片。Pst DC3000 ( avrRpt2 ) 细菌在 OD ₆₀₀为 0.2 时浸润，并在浸润后 (hpi) 约 7 小时拍摄图像。

B. 准备接种Pst菌株

1. 条纹出的Pst从-75℃冷冻机菌株上的Luria-海洋（LM）含有固体培养基的抗生素，和允许在一个30到生长℃下孵化2天。

2. 在补充有适当抗生素的 4-6 ml LM 液体培养基中培养细菌菌株 [ Pst DC3000为50 mg/L 利福平；50 mg/L 壮观霉素和 50 mg/L 利福平用于Pst DC3000 ( avrRpt2 )，其中包含具有壮观霉素抗性的pDSK600-avrRpt2构建体]，在 200 rpm 和 30°C 下振荡 12-16 小时。

注意：细菌培养应达到对数中期（OD ₆₀₀= 0.6-1.0）。

3. 将 1.5 ml 细菌培养物转移到 2 ml Eppendorf 管中，以 2,500 × g离心5 分钟收集。

4. 去除上清液，用 2 ml 无菌水重悬沉淀以洗涤。

5. 将菌液以 2,500 × g离心5 分钟，除去上清液，然后用 1 ml 无菌水重悬沉淀。

6. 用无菌水将细菌溶液调整到 OD ₆₀₀= 0.2 (~1 × 10 ⁸cfu/ml)的细胞密度，用分光光度计测量。

用于细菌疾病检测

C. 用Pst菌株接种拟南芥

1. 用无菌水将 B6 中的细菌溶液稀释到细胞密度从 OD ₆₀₀= 0.001 (~5 × 10 ⁵cfu/ml) 到 0.002 (~1 × 10 ⁶cfu/ml)。

2. 使用 1 ml 无针注射器（图 1C 和视频 1）用调整后的细菌溶液为每株植物接种 3 个标记的叶子（从叶子的背面）。我们估计大约需要 100-200 μl 才能完全渗入一片成年叶。我们通常每株接种4株植物，每盆接种不同株系的不同植株。

视频 1. 注射器渗透演示。

3. 用纸巾擦去渗入叶子表面的溶液。

4. 将接种过的植物在环境湿度下保持约 1 小时，以蒸发叶子中多余的水分。

5. 用透明塑料圆顶盖住托盘，以保持高湿度，直到采样，并将植物放回生长室，以便疾病发展（图 1D）。

D. 记录疾病症状并计算细菌数量

1. 2-4 天后收获样品（因不同的植物基因型/细菌菌株而异，因实验而异），从植物中取出所有接种的叶子，并拍照记录萎黄和坏死症状（图 1E）。

2. 选择代表症状的 6-8 片叶子（例如，中间层；图 1F），并将它们放入 75% 乙醇溶液中约 30 秒，以杀死叶表面的细菌。

3. 将叶子放在纸巾上以快速去除多余的乙醇，然后用消毒水冲洗叶子两次（图 1G）。

4. 用纸巾擦干叶子，使用软木钻孔器（直径 7.5 毫米）从每片叶子上取两个叶盘，从两片不同的叶子上取四个盘作为一个生物重复，将叶盘放入含有 200 μl 的 2 ml Eppendorf 管中消毒水和一到两个钢球（直径 5 毫米）；从每次处理中收集三到四次重复（图 1H）。

5. 通过 TissueLyser 在 30 Hz 下研磨叶盘 1 分钟。

6. 快速旋转提取的溶液 (5,000 × g , 10 s)，将溶液从管盖移至管内；打开管子，加入800 μl的无菌水到管子中，短暂涡旋，涡旋振荡器混匀（图1I）。

7. 用无菌水连续稀释菌液（即10×、100×、1,000×等），然后从每次稀释液中取10 μl置于添加了利福平（50 mg/L）的LM琼脂平板上. 对每个样品进行两次技术复制（图 1J），并在室温下风干板。

注意：将 1 ml 提取液中的 10 μl 置于 LM 琼脂平板上，这相当于将 4 个叶盘中的细菌稀释 100 倍。如果从1ml提取液中取10μl加入90μl无菌水中，再取10μl置于LM琼脂平板上，相当于再稀释10倍。通过重复此过程，对每个样品进行连续 10 倍稀释。对于 Pst DC3000，我们通常将提取的溶液稀释到 10 ^-4、10 ^-5和 10 ^-6，对 Pst DC3000 (avrRpt2)稀释到 10 ^-2、10 ^-3和 10 ^-4。

8. 将风干的 LM 琼脂平板置于 30°C 的培养箱中进行菌落生长。

9. 孵化后 24 小时用立体镜计数菌落（图 1K）。如果菌落分离良好并长到大尺寸（例如，孵育超过 24 小时后），也可以通过肉眼计数。

对于超敏反应测定

E. 用Pst菌株接种拟南芥植物

1. 使用 1 ml 无针注射器在细胞密度为 OD ₆₀₀= 0.2 (~10 ⁸cfu/ml) 的情况下，用Pst DC3000 ( avrRpt2 ) 菌株接种 3-4 个标记的叶子（从叶子的背面）（图 1C））。每个基因型接种 4-6 株植物。

2. 用纸巾擦去叶子表面的溶液，让叶子变干，然后将植物放回生长条件下，无需覆盖和环境湿度。从浸润后 4-5 小时开始检查组织塌陷。

注意：不同的效应蛋白导致不同的 ETI 反应强度和不同的 HR 率，因此不同的菌株可能需要不同的 HR 观察时间。

3. 收获叶子，计算显示细胞死亡的叶子数量，然后拍照（图 1L）。

注意：当发生细胞死亡时，离子会从细胞中泄漏出来，并且可以在渗透后的一段时间内使用电解电导率计测量电解质泄漏，从而提供一种更定量的评估 HR 的方法（Hatsugai 和 Katagiri 中描述的协议， 2018）。

数据分析

疾病检测数据分析：

1. 在 Microsoft Excel 中输入带有相应稀释因子的稀释度（我们通常选择 10-100 个菌落的稀释度进行计算）中的细菌数。

2. 平均每个样品的两个重复。将此平均值乘以多个稀释因子，以获得样本中的菌落总数（菌落形成单位，CFU）。例如，如果我们得到平均值为 56，稀释因子为 10 ^-5，则菌落总数为 56 × 10 ⁵CFU。

3. 计算总叶面积。一个直径7.5mm的叶盘的面积等于π乘以0.375的平方，所以面积是0.441786 cm ²；一个样品中有四个叶盘，因此总叶面积为 1.767 cm ²。

4. 将每个样品的细菌总数除以叶面积，得到单位面积的菌落数。该值代表植物的病害易感性，值越高，植物越易感病。例如，上述 step1 样本单位面积的菌落数为 56 × 10 ⁵/1.767 = 3169213 CFU/cm ²。

5. 取每个样品单位面积菌落数的以10为底的对数。例如，上述步骤 4 中的值为 Log ₁₀3169213 = 6.5 Log ₁₀(CFU/cm ²)。

6. 在 GraphPad 中输入所有样本的所有值，并计算 3 个生物重复的平均值和标准偏差 (SD)，绘制图形并使用 GraphPad 的 Tukey 检验使用双向 ANOVA 确定统计显着性（图 2）。

图 2. 疾病感染检测的示例图。

上图是由袁等人的疾病检测的一个生物学重复产生的。(2021)。Pst DC3000 ( avrRpt2 ) 细菌在 OD ₆₀₀为 0.002 时渗入拟南芥叶中，并在 3 dpi 时确定种群（平均值 ± SD；n = 3 个生物独立样本）。使用带有 Tukey 检验的双向 ANOVA 分析数据。

笔记

1. 我们发现植物健康状况是疾病表型的关键决定因素之一。受压或次优植物通常会产生不一致甚至相反的结果。室内的非生物条件（例如光强度/光周期、温度和水/土壤湿度）会影响植物的健康和基础防御水平。重要的是使用在优化条件下生长的健康植物，并且对病原体相关的检测具有最小化或低水平的基础防御。我们通常使用 10 或 12 小时光照，保持浇水频率/数量（每次不要浇太多，避免在托盘中留下积水），并在适当的年龄（通常在 4 周左右，因为老植物有时倾向于获得花青素积累和更高的基础防御）。在我们的分析中通常不使用在玫瑰花结中心看起来是深绿色或紫色的植物。被昆虫或真菌感染的植物也不能使用。

2. 叶龄可能会影响荷尔蒙水平和植物免疫力。在这些测定中应使用相似年龄的叶子。我们通常使用 3 片中年且从每株植物中完全展开的叶子。细菌剂量和采样时间（例如，第 2 天而不是第 3 天或第 4 天）可以在实验中进行调整，这取决于植物条件和使用的细菌菌株。

3. 光、温度和湿度等环境因素会影响疾病的发展和严重程度。我们发现疾病的发展对空气湿度非常敏感，因此我们通常用透明塑料圆顶（完全覆盖）覆盖接种的植物，以保持内部相对较高的空气湿度（图 1D，相对湿度高于 90%）3-4 天.

4. 对于过敏反应测定，伤口和叶龄似乎对细胞死亡率有主要影响。我们观察到注射器浸润过程中的机械损伤会显着加速组织塌陷。因此，在用注射器注射时应小心。我们还发现，较年轻的叶子通常与更快的细胞死亡有关，因此应该选择年龄相近的叶子进行公平比较，或者观察不太明显的 HR 表型。

食谱

1. Luria-Marine (LM) 培养基

胰蛋白胨 10 克/升

酵母提取物粉末 6 g/L

KH ₂PO ₄1.5 克/升

氯化钠 0.6 克/升

硫酸镁₄0.35 克/升

将成分溶解在蒸馏水中，用 10 N 氢氧化钠 (NaOH) 溶液将 pH 值调节至 7，然后将溶液高压灭菌。

对于 LM 固体培养基，在高压灭菌前在液体培养基中加入 15 g/l 琼脂粉。

2. 利福平原液 (1,000×)

将 2.5 g 利福平粉末溶解在 50 ml 二甲基亚砜 (DMSO) 中，制成 50 g/l 储备溶液，涡旋混合均匀，将溶液分装到1.5 ml Eppendorf 管中，并在 -20°C 下储存。

3. 壮观霉素原液 (1,000×)

将 2.5 g 壮观霉素粉末溶解在 50 ml 无菌水中制成 50 g/l 储备液，涡旋混合均匀，通过0.22 μm Millex-GP 注射器过滤器过滤消毒溶液，分装到 1.5 ml Eppendorf 管中，并储存在-20 °C。

致谢

这项工作得到了中国科学院、分子植物科学卓越中心/植物生理生态研究所、植物分子遗传学国家重点实验室和中国科学院战略重点研究计划（B类；项目编号： XDB27040211）。国家博士后创新人才计划资助项目（项目编号：BX2021313）。感谢中国农业大学范俊博士对土壤冷冻处理防治昆虫提出的建议。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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2. Gimenez-Ibanez, S.,Ntoukakis, V. 和 Rathjen, JP (2009)。LysM 受体激酶 CERK1 介导拟南芥中的细菌感知。植物信号行为4(6): 539-41。

3. Hatsugai, N. 和 Katagiri, F. (2018)。通过电解质泄漏测定法定量植物细胞死亡。生物协议8(5)：e2758。

4. Katagiri, F.、Thilmony, R. 和 He, SY (2002)。在拟南芥-假单胞菌丁香互动。 拟南芥书1：e0039。

5. Lewis Ivey, ML 和 Miller, SA (2000)。俄亥俄州辣椒细菌性溃疡病的第一份报告。植物 Dis 84(7): 810。

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7. Mazzaglia, A., Studholme, DJ, Taratufolo, MC, Cai, R., Almeida, NF, Goodman, T., Guttman, DS, Vinatzer, BA 和 Balestra, GM (2012)。丁香假单胞菌光伏。从最近爆发的猕猴桃细菌溃疡病中分离出的猕猴桃(PSA) 属于同一遗传谱系。PLoS 一7(5)：e36518。

8. Mindrinos, M.、Katagiri, F.、Yu, GL 和 Ausubel, FM (1994)。在拟南芥抗病基因RPS2编码含有核苷酸结合位点和富含亮氨酸的重复序列的蛋白。细胞78(6):1089-99。

9. Mudgett, MB 和 Staskawicz, BJ(1999)。丁香假单胞菌pv 的表征。番茄 AvrRpt2 蛋白：细菌发病过程中分泌和加工的证明。Mol Microbiol 32(5): 927-41。

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