材料和试剂

1. 裸鼠（杰克逊实验室，目录号：002019）

2. NOD SCID 小鼠（杰克逊实验室，目录号：001303）

3. 聚维酮碘制备垫（DYNAREX，目录号：1108）

4. 无菌酒精制备垫（DYNAREX，目录号：1116）

5. 27G ½'' 注射器（BD，目录号：305620）

6. 40 µm 细胞过滤器（Fisher Scientific，目录号：087711）

7. PC-3 电池（ATCC，目录号：CRL-1435）

8. Ham's F-12K（Kaighn's）中型（ThermoFisher，目录号：21127022）

9. FBS（Sigma，目录号：F2442）

10. 0.05% 胰蛋白酶-EDTA（ThermoFisher，目录号：25300054）

11. 0.4% 台盼蓝溶液（Sigma，目录号：T8145）

12. PBS（Sigma，目录号：806552-1L）

13. 异氟醚吸入麻醉剂（Southern Anesthesia & Surgical，目录号：PIR001325）

14. 人激肽释放酶 3/PSA Quantikine ELISA 试剂盒（研发系统，目录号：DKK300）

15. 14% EDTA（pH 7.4）（美国研究产品，目录号：BM-150A）

16. 10% 中性缓冲福尔马林（Sigma，目录号：HT501128）

17. 100% 乙醇（KOPTEC，目录号：89426-252）

18. 苏木精（Electron Microscopy Sciences，目录号：26043-05）

19. 曙红Y溶液（Millipore Sigma，目录号：102439）

20. Permount（Fisher Scientific，目录号：SP15100）

21. 二甲苯（Fisher Chemical，目录号：X54）

22. Immu-Mount（Epredia，目录号：9990402）

23. 无水乙酸钠（Sigma，目录号：S-2889）

24. L-（+）酒石酸（Sigma，目录号：T-6521）

25. 坚牢红紫LB盐（Sigma，目录号：F-3381）

26. 萘酚 AS-MX 磷酸盐（Sigma，目录号：N-4875）

27. 用于 TRAP 染色的基本染色缓冲液（参见配方）

28. TRAP 染色液（见配方）

29. 10% EDTA（见配方）

设备

1. 冷冻离心机（Eppendorf，型号：5810R ）

2. 气体麻醉系统（PerkinElmer，型号：XGI-8）

3. 加热垫（Sunbeam Products，目录号：2139885）

4. IVIS ^®光谱成像系统 (PerkinElmer)

5. MX-20 X 射线系统（Faxitron [亚利桑那州图森市]）

6. -80°C 冰箱（Fisher，目录号：TSU600ARAK）

7. 嵌入中心（Leica，目录号：EG1160）

8. 旋转切片机（徕卡，目录号：RM2135）

9. NanoZoomer 全玻片扫描仪（奥林巴斯、滨松）

软件

1. NDP.view2（滨松，https: //www.hamamatsu.com/us/en/product/type/U12388-01/index.html）

2. Living Image 软件（PerkinElmer，https://www.perkinelmer.com.cn/product/li-software-for-lumina-1-seat-add-on-128110）

程序

A. 收集新鲜培养的癌细胞

1. 在含有 10% FBS 的 F-12K 培养基中接种前列腺癌 PC-3 细胞。对于 PC-3 细胞，10 毫升培养基中每 10 厘米培养皿可容纳 50 万个细胞，是细胞培养的理想选择。在37°C 和 5% CO ₂的细胞培养箱中培养细胞。

2. 当细胞达到 80-90% 汇合时，每三天传一次 PC-3 细胞。请参阅以下有关传代 PC-3 细胞的程序：

a. 去除培养基并用 2 ml 无菌 PBS 清洗细胞。

b. 添加分离试剂 0.5% 胰蛋白酶-EDTA，并在 37°C 下孵育培养皿，直到细胞完全从培养皿中分离（PC-3 细胞大约需要 2 分钟）。

c. 添加 2 ml 含有 10% FBS 的新鲜培养基以灭活胰蛋白酶，并将细胞收集到 15 ml（或 50 ml）无菌离心管中。

d. 以 1,200 × g离心3 分钟以沉淀细胞。去除上清液并将细胞重悬在 3 ml 新鲜培养基中。计数细胞并执行步骤 A1 中描述的细胞培养程序。

3. 收集培养的 PC-3 细胞进行胫骨注射。对于 PC-3 细胞，当细胞在 10 厘米培养皿中达到 80%-90% 融合时，每个培养皿将收集大约 2-250 万个细胞。执行步骤 A2a-A2c 中描述的步骤，以在无菌离心管中收集细胞。按照以下步骤获得用于胫骨注射的单细胞悬液。

a. 以 1,200 × g离心3 分钟以沉淀细胞。去除上清液并在 20 ml 无菌 PBS 中重悬细胞。以 1,200 × g离心3 分钟以再次沉淀细胞。按照此程序两次用 PBS 清洗细胞。

b. 将细胞重悬在 20 ml 无菌 PBS 中，彻底吸取以获得单细胞悬液。用 40 µm 细胞过滤器过滤细胞，以保证单细胞悬液。

c. 计算 0.4% 台盼蓝溶液中的细胞数，以评估细胞活力并计算活细胞总数。

d. 以 1,200 × g离心3 分钟以沉淀细胞并去除上清液。大约 300-500 µl PBS 将留在离心管中。用移液管测量准确体积，然后加入适当体积的 PBS 以获得密度为 5 × 10 ⁷^个细胞/ml 的细胞悬液。

e. 关键步骤：准备足够的细胞。理想的细胞数约为所需细胞数的 1.5 到 2 倍。例如，如果胫骨注射需要 1000 万个细胞，则准备 15-2000 万个细胞。使用新鲜细胞进行胫骨注射。将细胞悬浮在 PBS 中直到胫骨注射; 例如，在胫骨注射前一小时内继续执行步骤 A3a-A3d。

B. 胫骨注射

1. 小鼠胫骨注射准备。胫骨注射程序的一般要求遵循啮齿动物生存手术的标准。

a. 使用 3% 异氟醚消毒工作表面并麻醉裸鼠。

b. 用 2.5% 异氟醚保持麻醉, 通过捏脚趾检查肌肉张力的脚趾反射。当没有脚趾反射时，动物被很好地麻醉。

c. 如果使用 NOD SCID 小鼠，请在麻醉前去除踝关节的毛发以暴露注射区域。

d. 通过腹腔注射以 0.1 毫克/千克的剂量施用丁丙诺啡。

e. 用 10% 聚维酮/碘拭子/溶液和 70% 乙醇清洁鼠标的双腿。重复三遍。

2. 用于胫骨注射的细胞制备。再次混合细胞以获得均匀的细胞悬液。取出柱塞并将 20 µl 细胞（100 万个细胞）从底部移入 27G ½'' 注射器中。再次安装柱塞并通过将柱塞缓慢推入内部来排除空气。垂直握住注射器，针头朝上，轻轻敲击注射器以去除任何气泡。一滴细胞悬液将从针头中流出，确保注射器中没有空气。

3. 胫骨注射（见视频 1）。

a. 用食指和拇指轻轻抓住外踝、内踝和胫骨下半部分，弯曲腿，做屈侧旋结合的动作。此时膝盖将可见且可触及。

b. 在牢牢抓住鼠标的脚踝/腿的同时，将一根没有细胞悬浮液的针插入髌骨下方，穿过髌韧带的中间，进入胫骨顶部的前髁间区域。我们首先使用一个空白注射器，以避免骨组织堵塞针头。

c. 将针头插入胫骨时，使用稳定而牢固的压力和轻微的钻孔动作引导注射器穿过生长板。在刺入胫骨生长板后，针头所遇到的阻力将明显减小。

d. 轻轻地横向移动针头，确保针头位于胫骨中并穿过生长板。由于针位于胫骨内的适当位置，因此运动将受到限制。

e. 取出空白注射器并按照相同的路线插入带有细胞悬浮液的注射器。轻轻移动针头，确保针头位于胫骨中并穿过生长板。非常缓慢地注入 20 μl 的细胞溶液。此时，不应感觉到任何阻力。

视频 1. 裸鼠胫骨注射过程。

该视频是根据埃默里大学动物护理指南在埃默里大学制作的，并由埃默里大学动物研究伦理委员会根据协议 #PROTO201700737 批准。

4. 在恢复期间将小鼠放在加热垫上。在前 72 小时内每 12 小时监测一次小鼠。

C. 监测胫骨的肿瘤发生

1. 通过 X 射线/微型计算机断层扫描 (CT) 监测骨病变。

a. 打开机器，等待“READY”绿灯亮起。

b. 在 20 KV 下预热机器 300 秒。

c. 在手术前通过腹腔注射氯胺酮 (80 毫克/公斤)/甲苯噻嗪 (10 毫克/公斤) 麻醉小鼠。通过捏脚趾监测麻醉深度。

d. 打开门，将胶片放入底部的暗盒中，“+”激光导板位于中心。

e. 将鼠标放在适当放大的托盘顶部，将其与“+”激光导板居中，然后关紧门。

f. 在 25 KV 下执行 X 射线成像 60 秒。

g. 扫描后，关闭机器，显影并固定胶片，然后将老鼠放回笼子里。

2. 如果肿瘤细胞预先标记有荧光素酶，则每周一次通过 IVIS 监测胫骨的肿瘤发生。

a. 对于用萤火虫荧光素酶预先标记的癌细胞，通过腹腔注射以 150 mg/kg 的剂量施用 D-荧光素。在成像前等待 15-20 分钟以获得最大荧光素酶信号。

b. 用 3% 异氟醚麻醉小鼠并保持在 2% 异氟醚。通过捏脚趾监测麻醉深度。

c. 使用 Xenogen IVIS 光谱成像系统 (PerkinElmer) 获取生物发光图像，并使用 Living Image 软件 (PerkinElmer) 测量小鼠胫骨区域的光子通量。请按照设备说明完成此步骤。

d. 扫描后，恢复笼子里的老鼠。

3. 监测血清中的前列腺特异性抗原 (PSA) 水平。

a. 一些前列腺癌细胞系（即LNCaP、C4-2、C4-2B）和患者来源的异种移植物（即LuCaP 23.1）在骨肿瘤发生过程中分泌 PSA（Li等，2021）。通过文献搜索或实验确定细胞系和患者来源的异种移植物中的 PSA 水平。

b. 小鼠采血可采用多种方法，每只小鼠采血150 µl足以测量血清中的PSA水平。在此，从侧尾静脉收集血液如下：

i. 在采血前至少 30 分钟在加热垫上加热动物。

ii. 使用尾部突出的机械约束装置来约束动物。

iii. 用 70% 乙醇清洁收集点。

iv. 将针平行于横向尾静脉，针的斜边朝上。

v. 将针头从尾部尖端开始插入静脉，然后轻轻吸出以通过注射器收集血液。如果使用蝴蝶针和真空采血管，这一步会更容易。

vi. 用纱布轻轻按压直到出血停止。

c. 采血后，在室温 (RT) 下静置 30 分钟，让血液凝结。通过以 2,000 × g离心管10 分钟去除凝块。小心收集黄色的上清液，称为血清。从 150 µl 全血中可以收集大约 50 µl。将血清储存在 -80°C 的冰箱中直至使用。

d. 按照制造商的说明，使用 PSA ELISA 试剂盒（即R&D System，#DKK300）测量血清中的 PSA 水平。

D. 骨组织采集及组织学分析

1. 骨组织加工

a. 对动物实施安乐死。从两侧肢体一起解剖胫骨、股骨和关节。至少应保留一些股骨，以解释肿瘤细胞可能从胫骨迁移到股骨的可能性。尽可能多地去除肌肉组织。将骨组织储存在 10% 中性缓冲福尔马林（10 毫升/骨样品）中，在室温下保存长达两周以获得最佳结果。

b. 用 10% EDTA (pH 7.4) 在 4°C 下脱钙骨组织 10 天。流体体积与组织的比率对于脱钙过程至关重要。使用至少 40 体积的 EDTA 对骨组织进行脱钙。例如，如果骨组织占据 0.5 毫升，则使用 20 毫升 EDTA。间歇性地摇晃以确保脱钙溶液在骨头周围流动。在第 5 天更换脱钙溶液。

c. 脱钙后，用蒸馏水冲洗骨组织一次，并将其储存在 70% 酒精（10 毫升/骨样本）中，以进行进一步的标准组织处理。

d. 将嵌入石蜡中的组织以 5 μm 厚切片，包括胫骨、膝关节和股骨远端。

2. 苏木精和伊红 (H&E) 染色

a. 在二甲苯中对未染色的载玻片脱蜡，并在乙醇梯度中重新水化，如下所示：

· 3 × 3 分钟二甲苯

· 2 × 3 分钟 100% 乙醇

· 1 × 3 分钟 95% 乙醇

· 1 × 3 分钟 80% 乙醇

· 1 × 3' 分钟 70% 乙醇

· 1 × 3 分钟去离子水

b. 用苏木精染色玻片 10 分钟，用去离子水冲洗两次，用 PBS 孵育 3 分钟。再用去离子水冲洗两次。

c. 将载玻片用伊红染色 30 秒，然后进行以下脱水程序：

· 2 × 3 分钟 95% 乙醇

· 2 × 3 分钟 100% 乙醇

· 3 × 10 分钟二甲苯

d. 使用 Permount 的盖玻片。使用玻璃棒在载玻片上滴一滴 Permount，注意不要留下气泡。在引擎盖中干燥过夜。

3. 抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP) 染色

a. 准备基本染色缓冲液和 TRAP 染色溶液（参见配方）并预热至 37°C。

b. 在二甲苯中对未染色的载玻片脱蜡，并在乙醇梯度中重新水化，如下所示：

· 3 × 3 分钟二甲苯

· 2 × 3 分钟 100% 乙醇

· 1 × 3 分钟 95% 乙醇

· 1 × 3 分钟 80% 乙醇

· 1 × 3' 分钟 70% 乙醇

· 1 × 3 分钟去离子水

c. 在 37°C 的烘箱中，将未染色的载玻片在基本染色缓冲液中孵育 20 分钟。

d. 在 37°C 的烤箱中，将载玻片在 TRAP 染色溶液中染色 30-45 分钟。每 15 分钟监测一次颜色变化，直到 TRAP 阳性区域变为红色。

e. 用苏木精复染载玻片 10 分钟，用去离子水冲洗两次，用 PBS 孵育 2 分钟。

f. 带有 Immu-Mount 的盖玻片用于分析。TRAP 染色会被乙醇溶解。如果需要 Permount，则将载玻片直接在二甲苯中孵育 10 分钟，然后重复两次以去除水分。

数据分析

A. X 射线图像

1. 查看小鼠胫骨的 X 射线图像，并以双盲方式确定肿瘤诱导的溶骨性和成骨细胞病变。

2. 评估骨溶解的程度，如图 1 所示。

注意：X 射线不是定量方法，因此没有广为接受的动物数据评分系统。

图 1. 胫骨承载 5 周 PC-3 肿瘤的 X 射线图像。

骨骼破坏的程度显示在每个图像的顶部。

B. 分析 H&E 染色载玻片中的肿瘤区域

1. 使用 Olympus Hamamatsu NanoZoomer 全玻片扫描仪以 40 倍放大率扫描整个 H&E 染色的组织玻片。

2. 使用 NDP.view2 软件中的手绘区域工具计算胫骨肿瘤样本中的总面积（图 2B）和肿瘤面积（图 2C）。通常，癌细胞具有不同的细胞核和更多的有丝分裂象。

3. 计算肿瘤面积与总面积的比率。

4. 根据需要显示具有更高分辨率的代表性图像（图 2）。

图 2. 5 周胫骨肿瘤的 H&E 染色。

显示的是 PC-3 胫骨肿瘤样本的 2.5x (AC)、10x (D) 和 40x (E) 放大倍率的代表性图像。AC 中的比例尺：500 µm。D 中的比例尺：100 µm。E 中的比例尺：50 µm。T，肿瘤组织。B、骨组织。BM，骨髓。M，肌肉组织。

C. 分析 TRAP 染色载玻片中的破骨细胞分化

1. 使用 Olympus Hamamatsu NanoZoomer 全玻片扫描仪以 40 倍放大率扫描整个 TRAP 染色的组织玻片。

2. 使用 NDP.view2 软件中的手绘线工具计算胫骨肿瘤样本中肿瘤和骨骼之间界面的长度。如果样本中存在多个界面，则计算长度之和。

3. 计数肿瘤和骨界面上TRAP阳性细胞的出现。

4. 计算肿瘤和骨界面上 TRAP 阳性细胞的平均出现率。

5. 根据需要显示具有更高分辨率的代表性图像（图 3）。

图 3. 5 周胫骨肿瘤中的 TRAP 染色。

显示的是 PC-3 胫骨肿瘤样本的 2.5 倍（A、B）、10 倍（C）和 40 倍（D）放大率的代表性图像。AB 中的比例尺：500 µm。C 中的比例尺：100 µm。D 中的比例尺：50 µm。T，肿瘤组织。B、骨组织。BM，骨髓。M，肌肉组织。使用 NDP.view2 在 B 中计算肿瘤和骨界面的长度。

食谱

1. 用于 TRAP 染色的基本染色缓冲液（在室温下储存长达 6 个月）

a. 无水醋酸钠 9.2 克

b. L-(+) 酒石酸 11.4 克

c. 通过加入醋酸将 pH 值调节至 4.7-5.0

d. 添加去离子水至总体积为 1 升

2. TRAP 染色液（使用前新鲜配制）

a. 用于 TRAP 染色的基本染色缓冲液：200 ml

b. 坚牢红紫 LB 盐：120 毫克

c. 萘酚 AS-MX 磷酸盐：20 毫克（溶于 1 毫升乙二醇单乙醚）

3. 10% 乙二胺四乙酸

加入 400 ml 去离子水稀释 1,000 ml 14% EDTA。

致谢

我们感谢埃默里大学的 Anthea Hammond 博士编辑手稿。我们感谢伯明翰阿拉巴马大学病理学系病理学核心研究实验室的 Dezhi Wang 博士处理骨组织。这项工作得到了国防部前列腺癌研究计划 W81XWH-18-1-0526 的资助。该协议是我们最近出版物的详细版本（Li等人，2021 年；Zhang等人，2021 年）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

动物研究得到埃默里大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准，协议编号为#PROTO201700737，验证时间为 7/12/2018 至 6/30/2024。

参考

1. 科尔曼，RE（2006 年）。转移性骨病的临床特征和骨骼发病风险。临床癌症研究12（20 Pt 2）：6243s-6249。

2. Campbell, JP, Merkel, AR, Masood-Campbell, SK, Elefteriou, F. 和 Sterling, JA (2012)。骨转移模型。 J Vis Exp (67)：e4260。

3. Coleman, RE, Croucher, PI, Padhani, AR, Clezardin, P., Chow, E., Fallon, M., Guise, T., Colangeli, S., Capanna, R. 和 Costa, L. (2020)。骨转移。Nat Rev Dis 引物6(1): 83。

4. James, ND, Spears, MR, Clarke, NW, Dearnaley, DP, De Bono, JS, Gale, J., Hetherington, J., Hoskin, PJ, Jones, RJ, Laing, R., et al 。(2015)。“多西他赛时代”新诊断的转移性前列腺癌的生存率：来自 STAMPEDE 试验对照组 917 名患者的数据（MRC PR08，CRUK/06/019）。 Eur Urol 67(6): 1028-1038。

5. Kuchimaru, T., Kataoka, N., Nakagawa, K., Isozaki, T., Miyabara, H., Minegishi, M., Kadonosono, T. 和 Kizaka-Kondoh, S. (2018)。通过尾动脉注射癌细胞的可靠小鼠骨转移模型。自然通讯9(1): 2981。

6. Li, X., Gera, L., Zhang, S., Chen, Y., Lou, L., Wilson, LM, Xie, ZR, Sautto, G., Liu, D., Danaher, A., et al . (2021)。非经典 EED-EZH2 信号的药理学抑制克服了前列腺癌的化学耐药性。治疗诊断学11(14): 6873-6890。

7. Zhang, B., Li, Y., Wu, Q., Xie, L., Barwick, B., Fu, C., Li, X., Wu, D., Xia, S., Chen, J.,等。(2021)。KLF5 的乙酰化维持 EMT 和致瘤性，导致前列腺癌的化学抗性骨转移。 国家通讯社12（1）：1714。