材料和试剂

100 µm 尼龙网（Greiner Bio-One，目录号：542000）
50 ml 注射器（BD，目录号：309653）
50毫升管（Greiner Bio-One，目录号：227270）
15毫升管（Greiner Bio-One，目录号：188261）
5 ml移液器（Greiner Bio-One，目录号：606180）
48孔板（Fisher Scientific，目录号：08-772-1C）
T-25 和 T-75 烧瓶（Greiner Bio-One，目录号：1186Q51 和 658175）
巴斯德吸管（Fisher，目录号：1367820D）
地塞米松（400 μ g/ml）（Sigma，目录号：D4902）
3,3',5-三碘-L-甲状腺氨酸（3.4 mg/ml）（Sigma，目录号：T6397）
Forskolin（0.411 mg/ml）（Sigma，目录号：F3917）
mEGF（10 μ g/ml）（Peprotech，目录号：315-09）
ITS（100×）（Corning Cellgro ITS，目录号：MT25800CR）
L-谷氨酰胺（100×）（Gibco Life Technologies，目录号：102374）
Pen/Strep（100×）（Thermo Fisher Scientific，目录号：15070063）
MEM-NEAA（100×）（Gibco，目录号：11140050）
EpCam G8.8 抗体（爱荷华大学杂交瘤银行）
Percoll（GE Healthcare，目录号：17089101）
PBS（Fisher，目录号：14190250）
透明质酸酶（Sigma-Aldrich，目录号：H3506）
胶原酶 D（Sigma-Aldrich，目录号：11088882001）
EpCam（鼠）（CD326，G8.8；DSHB，https: //dshb.biology.uiowa.edu/G8-8 ）
绵羊抗大鼠 IgG Dynabeads（Thermo Fisher Scientific，目录号：11035）
DMEM 带 F12（Gibco，目录号：11320033）
MEM-NEAA（Gibco，目录号：11140050）
三碘甲状腺原氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：T6397）
Pierce TM BCA 蛋白质测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：23227）
大鼠抗小鼠 CK19 IgG, Troma III (CK19) ( DSHB, https://dshb.biology.uiowa.edu/TROMA-III )
山羊抗大鼠抗体（Invitrogen，Fisher Scientific，目录号：PI31470）
驴抗小鼠 IgG 二抗 IRDye 800CW LI-COR（Biosciences，目录号：926-32212）
DNase I（罗氏，目录号：4716728001）
释放缓冲液 (Thermo Fisher Scientific)
EasySep TM Release Mouse PE Positive Selection Kit（Stem Cell Technology，目录号：17656）
PE抗小鼠CD326（Ep-CAM），抗体（Biolegend，目录号：118206）
DMEM 带 F1（Gibco，目录号：11320033）
FBS（Thermo Fisher Scientific，目录号：A4766801）
化学定义的脂质浓缩物（100×）（Gibco，目录号：11905031）
庆大霉素（50 mg/ml）（Gibco，目录号：15750-060）
MEM维生素溶液（100×）（Gibco，目录号：11120052）
冰醋酸（Fisher Scientific，目录号：A38S-500）
Pierce BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Scientific，目录号：PI23235）
β-肌动蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A5441）
Pierce Fast Western Blot Kit，ECL Substrate（Thermo Scientific，目录号：35055）
驴抗小鼠 IgG IRDye 800CW（LI-COR Biosciences，目录号：926-32212）
辣根过氧化物酶（Fisher Scientific，目录号：PI31470）
奥德赛系统 (LI-COR) ( https://www.licor.com/bio/odyssey-clx/ )
DPBS（Fisher，目录号：14190 250）
鼠尾胶原涂层溶液（20 ml）（细胞应用，目录号：122-20）

消化/灌注培养基
灌注介质（见配方）
消化介质（见配方）
隔离缓冲液（见配方）
地塞米松（400 μg/ml）（见食谱）
3,3',5-Triiodo-L-甲状腺氨酸（3.4 mg/ml）（见食谱）
毛喉素（0.411 毫克/毫升）（见食谱）
mEGF（10 μg/ml）（见食谱）
胶原蛋白涂层（见食谱）

设备

血细胞计数器（Sigma，目录号：Z359629-1EA）
离心机（Eppendorf，目录号：EP-5810S）
旋转器（Cambridge Scientific，目录号：17847）
镊子和手术刀（Fine Science Tools，目录号：11075-00；VWR，目录号：4-422）
摇床（Eppendorf，目录号：M1352-0000）
BD Accuri C6 流式细胞仪（BD Biosciences）
BD LSRFortessa 细胞分析仪（BD Biosciences，https: //www.bdbiosciences.com/en-in/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-analyzers/bd-lsrfortessa ）
Bio-Rad ChemiDoc TM MP 成像系统

软件

FlowJo 软件（版本 10.7.1；Tree Star, Inc., Ashland, OR）

程序

收获和组织分离
使用异氟醚麻醉小鼠。
打开腹腔。使用 50 ml 注射器，用 30 ml 灌注介质通过下腔静脉以 5 ml/min 的流速灌注肝脏，并切断门静脉以排出灌注介质。
取出肝脏并称重以将细胞数与肝脏重量相关联。
用手术刀刮掉灌注的肝脏; 这将有助于将胆管与肝实质的其余部分分开。使用镊子和手术刀将胆管和剩余的肝组织块切碎成非常小的碎片。
将切碎的碎片放入含有 10 毫升消化介质的50 毫升试管中。
将 50 ml 试管放入摇床中，在 37 ℃ 280 rpm 摇晃 30 分钟℃.
持续摇晃 30 分钟后，从摇床上取出试管，加入 5 ml (33%) 的热灭活 FBS。FBS 的加入使酶活性失活。
将细胞悬液通过 100 µm 尼龙网状细胞过滤器放入 50 ml 管中。
使用 3 毫升注射器柱塞通过过滤器刮擦和按压组织块。用 35 ml 隔离缓冲液清洗过滤器，并将体积补至 50 ml。
在 4°C 下以 300 × g离心7 分钟。
用隔离缓冲液清洗细胞两次。

通过梯度离心分离细胞
制作 percoll 梯度解决方案，如表 1 所示。

表 1. 用于细胞分离的 percoll 梯度溶液的浓度

表 1 中显示的计算对于四个肝脏来说是足够的。
将巴斯德吸管放入15 毫升管中。
在 6 ml 的 26.25% 密度梯度 percoll 中重悬细胞，并用巴斯德吸管加入 15 ml 管中。
使用5 ml 移液器，通过 Pasteur移液器加入 4 ml 41.5% 密度的 percoll，让它在管中的 26.25% 梯度层下流动。通过管中的巴斯德吸管加入 3 ml 73.3% percoll 溶液。73.3% 密度的溶液将在 41.5% 密度的溶液下分层，如图 2 所示。

图 2. percoll 梯度解的叠加

在 4°C下以 796 × g离心30 分钟，无间断。
从离心机中取出 15 ml 试管。
吸出肝细胞的上层并收集到 3 ml 含有胆管细胞的界面；将其放入 50 毫升管中。
通过在 4°C 下以 300 × g离心7 分钟，使用 50 ml 分离缓冲液洗涤细胞。再重复一次；这将有助于去除 percoll。
去除上清液并在 1 ml 隔离缓冲液中重悬细胞沉淀。
使用 Epcam PeCy7 标记的流式抗体在BD Accuri C6 流式细胞仪和 BD LSRFortessa 细胞分析仪上评估 Epcam 阳性细胞的分数（图 3）。
使用血细胞计数器计数细胞。

图 3. 使用梯度离心法分离的 Epcam+ 胆管细胞部分

使用 Dynabead 细胞分离试剂盒纯化/富集胆管细胞
在进行细胞分离之前清洗 Dynabeads。
将所需体积（基于细胞数）的珠子添加到管中。使用 1 ml 隔离缓冲液清洗 Dynabeads。
将管子放在磁铁中 2 分钟，然后丢弃上清液。
从磁铁中取出 15 ml 管，将珠子重新悬浮在 1 ml 隔离缓冲液中。
每 10 7 个细胞使用大约 10 μg EpCAM G8.8 一抗（大鼠 IgG），充分混合，并在 4°C 下在旋转器上孵育 20 分钟。
加入 2 ml 分离缓冲液并以 300 × g离心7 分钟来洗涤细胞。丢弃上清液。
在隔离缓冲液中重新悬浮细胞。添加 20μl 抗大鼠 IgG Dynabeads 到 15 ml 含有细胞的管中。在 4°C 下在旋转器上孵育20 分钟。
与 Dynabeads 孵育后，加入 1 ml 隔离缓冲液，上下吸管 2-3 次，并将管子置于磁铁中 4 分钟。
对于阳性隔离，当管仍在磁铁中时，小心地取出并丢弃含有未结合细胞的上清液。再重复一次步骤C8，去除未绑定的单元格；这将增加分离细胞的纯度。
在隔离缓冲液中重悬细胞沉淀，并通过在 4°C 下以 300 × g离心7 分钟来洗涤细胞。去除上清液并继续。

释放珠结合细胞
在 1 ml 释放缓冲液中重悬珠子结合的细胞。
在室温下滚动和倾斜孵育 15 分钟，然后通过上下移液 10 次混合，防止形成气泡。这将有助于有效地将细胞与珠子分离。
将管子放在磁铁中 4 分钟。
将含有无珠胆管细胞的上清液转移到新的 15 ml 管中。
将分离缓冲液加入 15 ml 并以 300 × g离心7 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬在 1ml 胆管细胞培养基中。使用血细胞计数器计数细胞。
将细胞保持在 2°C 至 8°C 之间，直到进一步用于下游应用。
从新生儿胆管细胞中分离的细胞如下所述扩增。
注意：除了上面讨论的方法。Epcam 阳性细胞可以使用 PE 抗小鼠 CD326 (Ep-CAM) Antibody 和 EasySep TM Release Mouse PE Positive Selection Kit进行纯化。此方法可在程序 B 中使用血细胞计数器计数细胞后使用。

胆管细胞的扩张
培养基：要制作 500 毫升的股票，请添加适当浓度的以下试剂（表 2）。

表 2.用于制备 500 ml 储备培养基的试剂清单

注意：要制作完整的培养基，请在开始细胞培养的当天在表 3 中添加以下补充剂。

表 3. 添加到库存中的试剂清单，以制作用于扩张胆管细胞的完整培养基
注意：含有 ITS、地塞米松、三碘甲腺原氨酸、mEGF 和 Forskolin 的完整培养基可使用 1 周。庆大霉素 (100 µg/ml) 用于胆管细胞培养。

培养/传代
注意：对于初始培养，从 48 孔板开始，待细胞汇合后移至 12 孔板；然后，根据需要将细胞转移到 T-25 或 T-75 烧瓶中。前几代细胞生长非常缓慢。
T-25烧瓶
要涂覆 1 个 T-25 烧瓶，添加 31 µl 胶原蛋白 (4 mg/ml) + 3 ml 0.1% 乙酸
T-75烧瓶
要涂覆 1 T-75，添加 94 µl 胶原蛋白 (4 mg/ml) + 5 ml 0.1% 乙酸
在室温下孵育 2 小时或在 4°C 下孵育过夜。
用 5 ml 无菌 PBS（使用 T-25 烧瓶时）洗涤去除涂层溶液。
用 PBS 轻轻摇动烧瓶；重复洗涤三到四次以去除乙酸。
如果传代，请使用 TrypLE 分离粘附的细胞。将 TrypLE 预热至 37°C。
用 5 ml 不含 Ca ++和 Mg ++的 DPBS 洗涤细胞。吸出并丢弃。
向烧瓶中加入适当体积的 TrypLE（T-25 中 2 毫升，T-75 烧瓶中 2-5 毫升）。
在 37°C 下孵育 2 至 4 分钟，直至细胞分离。如有必要，轻轻敲击烧瓶以去除细胞。
用不含 Ca ++和 Mg ++ 的13 ml DPBS 洗涤细胞。将细胞悬液转移到 15 ml 锥形管中。
在4°C 下以 300 × g离心7 分钟。弃去上清液，在预热的完全培养基中重悬细胞沉淀。计数细胞并相应地划分它们。几代后，细胞生长迅速；因此，根据需要拆分单元格。
在 BD Accuri C6 流式细胞仪上使用 Epcam PeCy7 标记的流式抗体检查培养细胞的纯度（图 4）。

图 4. 第 6 代的 Epcam+ 胆管细胞分数

CK19 和 β-肌动蛋白的免疫印迹在纯化和体外扩增的胆管细胞上进行。使用 Pierce TM BCA 蛋白质检测试剂盒对蛋白质进行定量，每条泳道使用 35 μg 蛋白质。
为了检测 β-肌动蛋白和 CK19，将膜与一抗在 4°C 下孵育过夜。
第二天，洗涤印迹并用辣根过氧化物酶二抗孵育。使用 ECL 底物，使用 Bio-Rad ChemiDoc TM MP 成像系统检测 CK19 。
β-actin 作为内参，用驴抗小鼠 IgG 二抗检测。使用 Odyssey 系统 (LI-COR) 对免疫印迹进行可视化（图 5）。

图 5. 第 6 代胆管细胞中 CK19 的表达

概括
胆汁淤积被定义为胆汁形成或流动的障碍，而胆汁淤积的病因不同，从基因突变到自身免疫。胆汁是肝细胞在肝脏中产生的消化液，肝细胞、胆管/胆管细胞和胰腺的疾病会导致胆汁淤积，导致胆汁盐在体内滞留。胆汁淤积期间沉淀的胆汁酸介导胆道损伤，并进一步导致胆管细胞闭塞，胆管细胞内壁被称为胆管树。胆管细胞损伤导致胆汁运输和胆汁修饰受阻。我们在 ABCC12 中鉴定了一个纯合的、无义的致病变异，编码腺苷 5'-三磷酸 (ATP) 结合盒 (ABC)-转运蛋白，多药耐药相关蛋白 9 (MRP9)。这些患者引起胆管缺乏，同时显示较低的 GGT 水平。MRP9 转运蛋白的表达仅限于肝脏中的胆管细胞。到目前为止，还没有讨论过这种转运蛋白在肝脏中的作用。因此，我们旨在使用从新生儿和成年小鼠中分离的原代胆管细胞探索 ABCC12 的作用及其生物学功能。从 2 天大的幼崽和成年小鼠中分离出胆道上皮细胞。在成年小鼠中，肝脏是p erfused用DMEM +含有胶原酶D.肝组织F12培养基切成小块，并进一步用胶原酶d，透明质酸酶，和DNA酶I.然后，将5 ml热灭活的FBS加入到消化d igested组织以灭活酶。消化物进一步用含有 10% FBS 的 DMEM+F12洗涤。三种不同浓度/密度的 percoll 用于分离胆管细胞。将重悬在 percoll 中的细胞以 2,000 rpm 的速度离心 30 分钟，无需刹车。收集界面层，用DMEM+F12洗涤，并与 EpCAM Ab孵育以从其余肝细胞中纯化胆管细胞。洗涤细胞并用 Sheep Anti-Rat IgG Dynabeads 孵育，然后使用磁柱将珠结合的Epcam 阳性细胞与其他细胞分离。Epcam 阳性细胞用于不同的实验或体外扩增以鉴定ABCC12 在胆管细胞中的作用。我们最近在胃肠病学（Pham等人，2021 年）上发表的研究中使用了该方案。

食谱

灌注介质
50 ml DMEM F12 + 500 µl (1 mg/ml) 胶原酶 D + 1% FBS
消化介质
30 ml DMEM + 15 mg 胶原酶 D + 15 mg 透明质酸酶 + 200 μl 200 mM CaCl 2 + 200 μl 200 mM MgSO 4 ，DNases I（10 U/ml）。
隔离缓冲器
500 ml不含Ca 2+和 Mg2+ 的 PBS，补充有 0.1% BSA 和 2 ml 0.5 M；最终浓度为 2 mM EDTA 和 pH 7.4。
地塞米松（400 微克/毫升）
称取 4 mg 地塞米松。
用2-4毫升乙醇溶解。
将无菌培养基添加到 10 毫升。
3,3',5-三碘-L-甲状腺氨酸（3.4 毫克/毫升）
将 100 mg 三碘-L-甲状腺氨酸粉末溶解在 2 ml 1 N NaOH 中。
置于 50 毫升管中。
添加 27.4 毫升无菌培养基，共 29.4 毫升。
毛喉素 (0.411 毫克/毫升)
在 5% DMSO/H 2 O（1.2 ml DMSO + 23.1 ml 无菌 H 2 O）中溶解 10 毫克毛喉素。
表皮生长因子（10 微克/毫升）
将 100 µg 溶解在 10 ml 1× PBS/1% BSA 中。
胶原蛋白涂层 4 毫克/毫升
制作 0.1% (~0.02 M) 醋酸溶液：在 dH 2 O 中稀释冰醋酸 (17.5 M) 1:1,000 。计算以 5 µg/cm 2涂覆菜肴的胶原蛋白量。要涂覆一个 T-25 烧瓶，将 31 µl 胶原蛋白 (4 mg/ml) 添加到 3 ml 0.1% 乙酸中。

致谢

作者要感谢辛辛那提儿童医院医疗中心自身免疫性肝病中心和 R01 DK095001 (AM) 对这项工作的支持。

利益争夺

所有作者均声明无利益冲突。

伦理

辛辛那提儿童研究基金会（俄亥俄州辛辛那提）的实验动物护理和使用委员会批准了此处描述的工作。

参考

Alvaro, D.、Mancino, MG、Glaser, S.、Gaudio, E.、Marzioni, M.、Francis, H. 和 Alpini, G. (2007)。增殖的胆管细胞：患病肝脏中的神经内分泌室。胃肠病学132（1）：415-431。
Asai, A.、Miethke, A. 和 Bezerra, JA (2015)。胆道闭锁的发病机制：定义生物学以了解临床表型。Nat Rev Gastroenterol Hepatol 12(6): 342-352。
Banales, JM, Huebert, RC, Karlsen, T., Strazzabosco, M., LaRusso, NF 和 Gores, GJ (2019)。胆管细胞病理学。Nat Rev Gastroenterol Hepatol 16(5): 269-281。
Carey, AN, Zhang, W., Setchell, KDR, Simmons, JR, Shi, T., Lages, CS, Mullen, M., Carroll, K., Karns, R., Bessho, K., et al 。(2017)。肝脏 MDR3 表达影响脂质稳态和新生儿炎症性胆管阻塞的易感性。Pediatr Res 82(1): 122-132。
Chen, XM, O'Hara, SP 和 LaRusso, NF (2008)。胆管细胞的免疫生物学。免疫细胞生物学86(6): 497-505。
Dyson, JK, Beuers, U., Jones, DEJ, Lohse, AW 和 Hudson, M. (2018)。原发性硬化性胆管炎。柳叶刀391(10139)：2547-2559。
Fickert, P. 和 Wagner, M. (2017)。肝胆损伤中的胆汁酸——有什么联系？J Hepatol 67(3): 619-631。
Gordillo, M.、Evans, T. 和 Gouon-Evans, V. (2015)。协调肝脏发育。发展142(12)：2094-2108。
Govindarajan, KK (2016)。胆道闭锁：我们现在处于什么位置？World J Hepatol 8(36): 1593-1601。
Kelly, DA 和 Davenport, M. (2007)。胆道闭锁的当前管理。Arch Dis Child 92(12)：1132-1135。
Lazaridis, KN 和 LaRusso, NF (2016)。原发性硬化性胆管炎。N Engl J Med 375(25): 2501-2502。
Malarkey, DE、Johnson, K.、Ryan, L.、Boorman, G. 和 Maronpot, RR (2005)。对肝脏形态功能方面的新见解。毒理学Pathol 33（1）：27-34。
Miethke, AG, Zhang, W., Simmons, J., Taylor, AE, Shi, T., Shanmukhappa, SK, Karns, R., White, S., Jegga, AG, Lages, CS, et al . (2016)。顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白的药理学抑制改变胆汁成分并阻止多药耐药 2 基因敲除小鼠中硬化性胆管炎的进展。肝病学63(2)：512-523。
Pham, DH, Kudira, R., Xu, L., Valencia, CA, Ellis, JL, Shi, T., Evason, KJ, Osuji, I., Matuschek, N., Pfuhler, L.,等。(2021)。在特发性慢性胆汁淤积症中检测到 ABCC12 中的有害变异并导致模型生物的肝内胆管丢失。胃肠病学161(1)：287-300 e216。
Pinto, C.、Giordano, DM、Maroni, L. 和 Marzioni, M.（2018 年）。炎症和促炎细胞因子在胆管细胞病理生理学中的作用。Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis 1864（4 Pt B）：1270-1278。
Sebode, M., Peiseler, M., Franke, B., Schwinge, D., Schoknecht, T., Wortmann, F., Quaas, A., Petersen, BS, Ellinghaus, E., Baron, U., et艾尔。(2014)。原发性硬化性胆管炎患者FOXP3 +调节性 T 细胞减少与 IL2RA 基因多态性相关。J Hepatol 60(5): 1010-1016。
Shah, A.、Macdonald, GA、Morrison, M. 和 Holtmann, G.（2020 年）。针对肠道微生物组作为原发性硬化性胆管炎的治疗方法：概念框架。Am J Gastroenterol 115(6): 814-822。
Taylor, AE, Carey, AN, Kudira, R., Lages, CS, Shi, T., Lam, S., Karns, R., Simmons, J., Shanmukhappa, K., Almanan, M., et al . (2018)。白细胞介素 2 促进肝脏调节性 T 细胞反应并防止小鼠硬化性胆管炎中的胆道纤维化。肝病学68（5）：1905-1921。
Wunsch, E., Trottier, J., Milkiewicz, M., Raszeja-Wyszomirska, J., Hirschfield, GM, Barbier, O. 和 Milkiewicz, P. (2014)。原发性硬化性胆管炎患者停用熊去氧胆酸的前瞻性评估。肝病学60(3)：931-940。
佐恩，A.（2008 年）。肝脏发育。在：StemBook（互联网）。马萨诸塞州剑桥：哈佛干细胞研究所。
版权所有 © 2021 作者；独家被许可人 Bio-protocol LLC。 1