材料和试剂

耗材
锥形底微量离心管，1.5 ml
锥形底离心管，50 ml 和 15 ml
移液器吸头（P1000、P200 和 P10）

植物材料
P 。冷杉和P 。西尔维斯特 L . 从于默奥大学校园 (63.8202° N, 20.3054° E) 自然生长的树木中收集的植物材料

试剂
Invitrogen NativePAGE Bis-Tris（3 - 12% w/v 梯度和 1.0 mm 厚度，目录号：BN1001BOX ）
Precision Plus 蛋白质双色标准品（SDS-PAGE 分子标记；Bio - Rad ，目录号：1610374 ）
SYPRO-红宝石染色（ThermoFisher ，目录号：S12001 ）
APS（过硫酸铵，Sigma ，目录号：A3678 ）
Trizma（Sigma-Aldrich ，目录号：93362 ）
Tricine（Sigma-Aldrich ，目录号：T0377 ）
十二烷基磺酸钠小号ulphate（SDS）（Sigma-Aldrich公司，目录号：436143 ）
Serva Coomassie Blue G（SERVA Electrophoresis ，目录号：17524.02 ）
Bis-Tris（Sigma-Aldrich ，目录号：14879 ）
6-氨基己酸（Sigma-Aldrich ，目录号：A7824 ）
甘油（Sigma-Aldrich ，目录号：G5516 ）
奇迹布（默克密理博）
研磨缓冲液 (B1) （见配方）
冲击缓冲器（B2）（见配方）
存储缓冲区（B3）（见配方）
丙酮水溶液（80%）（见配方）
洗涤缓冲液 1（WB1）（见配方）
洗涤缓冲液 2（WB2）（见配方）
洗涤缓冲液 3（WB3）（见配方）
溶解 BTH 缓冲液（SB）（见配方）
正十二烷基-α-D-吡喃麦芽糖苷（α-DDM）（见食谱）
洋地黄皂苷（见食谱）
100 mM α-DDM 工作溶液（见配方）
100 mM 毛地黄皂苷工作溶液（见配方）
加载缓冲液（LB）（见配方）
运行缓冲液 (RB) （见配方）
软染色溶液（见配方）
丙烯酰胺溶液 A（ThermoFischer）（见配方）
丙烯酰胺溶液 B（ThermoFischer）（见配方）
阴极 SDS 缓冲液（CB）（见配方）
阳极SDS缓冲液（AB）（见配方）

设备

Blender (Multiblender Coline, Clas Ohlson)
自动移液器（P1000，P200 ，和P10）
加热块 (95°C)
冷却微量离心机（Eppendorf ，型号：4530）
微量离心管摇床（Orbit TM Digital Microtube and Microplate Shaker）
Hoefer 电泳室（型号：SE260 Mighty Small II）
Bio - R ad 电泳槽 (迷你)
Bio - Rad mini-PAGE 浇铸装置
电源（Bio - Rad Power pack ultra）
pH计（Bio - Rad ）
UV-VIS 分光光度计 (Lum ina, 扫描范围 150-800 nm)

软件

Chemidoc 成像系统（Bio - Rad Image Lab 版本 6）

程序

样品采集
成熟针从树枝剪有一对剪刀，在收集到玻璃烧杯中，并保持在冰上（T≤0℃）中的暗。
在六月和七月的阳光明媚的日子里，从五个不同P的朝南枝条收获针叶。sylvestris和P . 于默奥大学校园内生长的冷杉(63.8202° N, 20.3054° E)。
切割后，将样品收集到玻璃烧杯中（每个生物重复使用一个单独的冰箱）并放置在冰箱中（35-40 厘米深；3/4 充满冰和 1/4 顶空）。
收集大约 3-4 根小树枝（10-15 克针）后，整个冰箱用双层厚黑布覆盖，以确保在2-5分钟的运输时间内在阳光明媚的夏日里保持黑暗。实验室。
在实验室中，样品立即在冷室（T ≤ 4°C）中在昏暗的绿光下进行隔离。在没有从收集分支点未直到隔离完成了从移动样品或者冰箱/冷室或黑暗（参见图小号1用于采样收集过程和工作设置）。

类囊体分离
注：这一步必须执行主编在寒冷的房间。
（需要缓冲液 - B1、B2 和 B3；水和缓冲液在冷藏室中保存过夜）
根据 Bag等人的方法制备样品。（2020）的方法稍加修改š最大化蛋白复合物隔离。简而言之，在冰冷的蒸馏水中洗涤大约 10-15 克（鲜重）的针；然后，100-150毫升冰冷的研磨缓冲液（B1）中加入（1:10比率针的缓冲），并且将混合物混合有高速搅拌器和在4℃下在预冷却的15秒5次重复，具有一个30 - s各自共混步骤之间间隙[高数量的混合步骤（5-6）在低混合时间（15-20 S）和时间的流逝各混合步骤之间（25-40或多个）是重要用于分离完整的高阶复合物] 。
通过两个过滤的共混针MIRACLOTH的层（默克Millipore）中并离心（4 ，500 ×克8分钟，在4℃）。将得到的沉淀重新悬浮于30-35毫升休克缓冲液（B2）并离心（4 ，500 ×克8分钟，在4℃）。
随后在存储缓冲液 (B3) 上重新悬浮，然后进行两步离心，首先以低速（200 × g ，2 分钟，4°C，丢弃沉淀），然后以更高速度（4 ，500 × g 8 分钟，4°C）。
将最终获得的沉淀物重新悬浮在 800 µl B3 缓冲液中，分成小份（50-100 µl），立即使用或在液氮中冷冻并储存在-80°C 以备进一步使用。在所有步骤中，将沉淀物resuspen DED薄头发漆刷以防止过度的机械剪切，这可能会损坏高阶蛋白复合物。

叶绿素浓度测定
考虑叶绿素和叶绿素结合蛋白之间的化学计量关系，样品浓度表示为毫克的在一个的Chls毫升样品。
叶绿素浓度从10微升在0.99毫升80％的提取的样品的计算出的冰冷的丙酮（1毫升最终体积）通过严格的涡旋直至没有团块可以看出（约2分钟;更多的时间可能需要如果样品是非常厚的）。
涡旋后，将管以8 , 000 × g离心5 分钟，并根据 Porra等人的方法进行测量。(1989)。

天然条件下蛋白质复合物的样品制备、电泳和分离
注：这一步必须执行主编在寒冷的房间。
针叶树样品的主要优化方法从这部分开始。从这里开始，步骤按时间顺序使用与图形说明（图 1）中出现的相同数字表示。的体积和浓度的样品，缓冲剂，和洗涤剂只着眼于最佳去污剂浓度，允许最大的分离。表 1 和 2 中提供了不同测试去污剂浓度所需的样品、缓冲液和去污剂。

图 1. 溶解、凝胶运行和条带识别的图示

表 1.随着 α-DDM 浓度的增加而增溶。该表显示增溶缓冲液（SB）和体积的体积/用于获得增加洗涤剂到F中呈现叶绿素比值α-DDM的浓度IG URE 2。

*体积是指 100 mM α-DDM工作溶液（参见配方）。

表 2.增加毛地黄皂苷浓度的增溶作用。该表显示SB和体积的体积/毛地黄皂苷用于获得增加洗涤剂到F中呈现叶绿素比的浓度IG URE 3.这里，两步溶解涂布：第一，5mM的α-DDM，表示为常数1微升在洗涤剂体积柱，加入前5分钟，以洋地黄皂苷，其中加入根据所需的浓度（改变量在洗涤剂体积列）。

*体积指的是 100 mM毛地黄皂苷工作储存溶液（参见配方）。

洗涤类囊体样品
（需要缓冲液 - WB1、WB2 和 WB3）
考虑到针叶树针中单宁和多酚含量高，天然复合物的分离在溶解前需要几个洗涤步骤；否则，去污剂的活性就会受到限制。在这里，我们在增溶前使用了三种不同的洗涤缓冲液。首先，将250μl WB1的是在Eppendorf管等分和类囊体的一定体积小号对应于10微克的叶绿素被通过混合悬浮通过旋动移液管在所述管（涡旋或吹打上下严禁因为这可以破坏蛋白质复合体）。此后，样品进行离心（3 ，0 00 ×克2分钟，在4℃），弃去上清液。然后，同样的过程被重复了两次，一次与WB2和曾经与WB3。
类囊体增溶
（需要缓冲器 - SB）
对于类囊体增溶，根据所使用的去污剂可采用两种不同的方法。
首先，对α-DDM溶解，我们溶解的洗涤类囊体沉淀在8-9 SB的微升（取决于粒料尺寸，颗粒越大，将较小的SB的体积其应该被添加）以获得10微升最终体积重新悬浮的洗涤类囊体。以这种方式，所述叶绿素升样品的浓度为1毫克/毫升。在SB，100mM的溶解后Ñ十二烷基-α-D-麦芽糖苷（α-DDM）加入在等体积（获得最终浓度叶绿素等于0.5毫克/毫升和一个洗涤剂叶绿素升比的50:1 ) 并在 4°C 下在冰上溶解 30 分钟。
施加分数增溶方法如洋地黄皂苷增溶据报道，在不成功拟南芥协议（贾维等人，2011; Rantala等人，2017）。首先，在类囊体SB中溶解作为befor E要1:1的叶绿素浓度毫克/毫升，然后将1μl的100mM Ñ十二烷基-α-D-麦芽糖苷（α-DDM）中并将样品在冰上放置5分钟然后，6微升100mM毛地黄皂苷的是加入最终体积填充至20微升用SB（最终叶绿素浓度为0.5毫克/毫升和所述洗涤剂叶绿素比30：1）。ģ entle摇动被施加到管（最大200rpm下在轨道TM数字微型试管及微孔板摇），并溶解在4℃下25分钟进行。
最后，既溶解样品进行离心（14 ，000 ×克25分钟，在4℃），将得到的上清液被用作所有analys ê S IN这项工作中提出。
BN-PAGE工艺
Blue-Native 聚丙烯酰胺凝胶电泳
（需要缓冲区 - LB 和 RB）
BN-PAGE进行了使用3 - 12％w / v的梯度和1.0毫米的厚度预铸10个孔凝胶。装载前，制备样品在1:10在上样缓冲液的比。甲样品16微升的体积装填，其对应š至8微克/毫升的Chls的每个电泳泳道的最终浓度。在上样之前，预制凝胶需要安装在电泳室上，槽需要填充运行缓冲液并冷却至 4°C。对于我们的样品，我们使用低于零的水浴在整个运行期间将电泳系统的温度保持在 2°C 以下。
天然电泳条件
运行在 65 V 的 Hoefer 电泳室上在 4°C 下在黑暗中进行 14 小时（或过夜）。运行缓冲液为具有阳极和相同的组成的阴极，但在使用前，阴极缓冲液补充有加样缓冲液以1：1的比率，000。
后BN-PAGE过程
软染色和凝胶图像采集
电泳结束后，将凝胶从卸除的电泳室和铸造板和在蒸馏水中洗涤，固定并染色。BN-页面用染色的根据Farci描述的程序软染色溶液（图2）等。(2017)。使用数码相机（Canon EOS RP digital）在白光LED 透射照明器上对凝胶成像。

图 2. 松树 (A, B) 和云杉 (C, D) 类囊体与不同浓度的 α-DDM 的增溶作用。A和C是用数码相机拍摄的软染色凝胶的 RGB 图像。B和D是相同凝胶的考马斯染色图像。

二维变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
对于 2D 分离，根据 Haniewicz等人的方法进行了变性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 。(2013)。简而言之，将来自 BN-PAGE 的条带在室温下用 Rotiload (Roth) 切除并变性 20 分钟。变性后，将条带置于 10% 变性 SDS-PAGE（1.5毫米厚）的顶部，并用阴极缓冲液中的 0.5% (w/v) 琼脂糖密封。通过使用多项式曲线绘制延迟因子值（Rf，带迁移的长度/染料前沿的长度）与分子标记的分子量对数来估计由 2D SDS-PAGE 分离的复合物的分子量配合（二阶多项式的最佳拟合），根据该制造商的说明。获得的曲线用于计算 2D SDS-PAGE 点的等效 Rf 处的表观质量（数据未显示）。将质量与w酯印迹数据相结合，用于识别 PSI 和 PSII 亚基（参见步骤 5b）。
变性电泳条件
物上的执行的运行生物- Rad公司电泳室和在75伏进行了3小时，在4℃下，在黑暗中。使用新鲜制作的阴极和阳极运行缓冲液。
后 2D SDS-PAGE 工艺
染色和凝胶图像采集
电泳结束后，将凝胶从卸除的电泳室和铸造板和在蒸馏水中洗涤，固定并染色。根据制造商的方案，使用 SYPRO-ruby 染色（图 4 和 5）对 2D SDS-PAGE 进行染色。使用数码相机（Chemidoc成像系统）在白光 LED透射照明器上对凝胶成像。
蛋白质印迹分析
2D SDS-PAGE后，将蛋白质转移的PVDF膜上，并进一步用于瓦特西部时代印迹分析和PSI和PSII抗体的识别，如在描述的袋等。(2020)。

数据分析

优化洗涤剂的浓度
分离的天然类囊体膜按照方法在两种不同的去污剂正十二烷基-α-D-麦芽糖苷（α-DDM）和毛地黄皂苷中溶解。的类囊体膜的复合物的分离在很大程度上取决于样品的最佳增溶（Haniewicz等人，和洗涤剂以叶绿素比可以变化，2015）从物种的物种（Kouřil等人，2016;Kouřil 。等人，2020） . 对于这两种去污剂，我们使用了一系列浓度，如图 2 所示。对于 α-DDM，我们从已知的最低去污剂浓度 (0.5% w/vol =10 mM = 10:1 D:Chls) 开始释放复合物（就我们所知）在其他植物物种（邵等人，2011），和浓度为营养不良的人口增加编高达70毫米的10mM增量（图2）。随着增加去污剂浓度，配合物的增加，并且达到释放的最大在50毫米。值得注意的是，以前据报道，使用的40mM的β-DDM释放Ç 2 š 2中号2为最大的复合物，但在这里，释放的50mMα-DDM更大从膜复合物（图2和图3 )，远大于在拟南芥中发现的C 2 S 2 M 2复合物。最有可能的是，这些带可能类似于先前在针叶树中发现的高阶超级复合体（Kouřil等，2020）。
对于毛地黄皂苷增溶，使用了类似的从 4 mM（0.4% w/vol = 4:1 D:Chls）增加洗涤剂浓度的方法，但与用于其他物种的协议（Järvi等人，2011 年）未能释放任何复合物完全（图S 2）。然后我们用非常低浓度的 α-DDM (5 mM)补充毛地黄皂苷，因为已知这种增溶方法可以更好地释放高阶复合物（Wientjes等人，2013 年）。此外，我们获得了清晰的ER与两步溶解（图3）的结果，在这些方法中所解释和先前报道的其他物种，其中它被命名为“差异溶解”（Haniewicz等人，2015）。从不同的洗涤剂浓度中，我们选择了 32 mM 的毛地黄皂苷，以在两步溶解过程中与 0.25 mM α-DDM 结合使用时实现复合物的最大释放。通过这种方式，总共六个高阶复合物（分子量较高的权重比PSII二聚体和PSI单体）可被分离。所述条带从1-6从较高分子量的起始命名（图URE 3E和3 F）。

图 3. 松树 (A, B) 和云杉 (C, D) 类囊体与不同浓度的毛地黄皂苷的增溶作用，辅以 5 mM α-DDM。A和C是用数码相机拍摄的软染色凝胶的 RGB 图像。B和D是相同凝胶的考马斯染色图像。B 和 D 中标记的红色框分别在插图 E 和 F中以高对比度放大和描绘。这些节目6高阶复合物（较高分子量的卫克HTS比PSII二聚体和PSI单体）ħ ERE从B1到B6从较高分子量的起始命名。

从 1D BN-PAGE 条带的 2D SDS-PAGE 鉴定复合物
已在拟南芥和烟草中鉴定在天然凝胶上分离的类囊体膜蛋白复合物（Järvi等人，2011 年；Haniewicz等人，2015 年；Farci等人，2017 年）。ř ecently ，鷉等。(2019) 从天然P 中鉴定出蛋白质。β-DDM 增溶释放的冷杉复合物。我们使用从这些图中的信息来识别从松复合物的蛋白质组合物（图4C- II ，D- II ）和云杉（图5C- II ，D- II ），并比较这些已知拟南芥通过运行映射拟南芥类囊体并行（图 4 和图5C- i 、D- i ）。

图 4. 通过 1D BN-PAGE 条带的 2D SDS-PAGE 鉴定可能存在的类囊体蛋白。松树 (Psl) 和拟南芥(Ath) 类囊体样品的 α-DDM ( A ) 和毛地黄皂苷增溶 ( B ) 的比较。从 α-DDM 溶解的拟南芥( Ci ) 和松树 ( C-ii )切下的 1D 条带 ( C ) 的2D SDS-PAGE ；从毛地黄皂苷溶解的拟南芥( Di ) 和松树 ( D-ii )切下的 1D 条 ( D ) 的2D SDS-PAGE 。

图 5. 通过 1D BN-PAGE 条带的 2D SDS-PAGE 鉴定可能存在的类囊体蛋白。云杉 (Pab) 和拟南芥(Ath) 类囊体样品的 α-DDM ( A ) 和毛地黄皂苷增溶 ( B ) 的比较。从 α-DDM 溶解的拟南芥( Ci ) 和云杉 ( C-ii )切下的 1D 条带 ( C ) 的2D SDS-PAGE ；从毛地黄皂苷溶解的拟南芥( Di ) 和云杉 ( D-ii )切下的 1D 条带 ( D ) 的2D SDS-PAGE 。

α-DDM 溶解的 BN 条带的2D SDS-PAGE（图 4C- ii和图 5C- ii ）显示第一条带和第二条带主要包含 PSII 蛋白，即CP47、CP43、D1、D2 和 LHCII（在compari儿子从鷉带图案等人，2020）。没有斑点或条带可以分配给 PSI 蛋白；因此，我们得出结论，这些条带很可能包含更高阶的 PSII 复合物（PSII 的超聚体或超聚体或寡聚体）。
相反，在毛地黄皂苷的2D SDS-PAGE溶解BN条，所述第一条带（图4D- II和图5D- II ）同时含有PSI和PSII蛋白，提示的任何三种复合物的存在，PSI-LHCI-PSII- LHCII（Rantala等，2017）、PSII-LHCII 和 PSI-LHCI 低聚物（Kouřil等，2020）。第二和第三条带主要富含 PSII 亚基，而第四和第五条带同时包含 PSI 和 PSII 亚基。最后，最后一个波段主要由 PSI 核心亚基 LHCI 和 LHCII 代表，但不包含PSII 核心亚基，表明该波段是 PSI-LHCI 或 PSI-LHCI-LHCII。多种复合物的这种可能性源于这样一个事实，针叶树，还有独特的高层次复合物中不存在所谓的模型植物，如拟南芥。

未来展望
此协议用于类囊体增溶的建立与非离子型去污剂促进小号高阶复合物的进一步研究从针叶树，例如，通过质谱或冷冻电镜。这将有助于更好地了解针叶树光合适应的基础，例如，在北方冬季。

食谱

不è ：库存/工作方案和缓冲区在Milli准备- Q水。
研磨缓冲液（B1）
50 mM H EPES -KOH pH 7.5
330 mM 山梨糖醇
5 毫米氯化镁2
10% (w/v) PEG 6000
10 毫米氟化钠
1 毫米牛血清白蛋白
0.65 mM 抗坏血酸钠
减震器(B2)
50 mM HEPES -KOH pH 7.5
5 毫米氯化镁2
10 毫米氟化钠
存储缓冲区(B3)
50 mM HEPES -KOH pH 7.5
5 毫米氯化镁2
100 mM 山梨糖醇
10 毫米氟化钠
丙酮水溶液
80% 丙酮
20% 水
洗涤缓冲液 1 (WB1)
的50mM的Bis-Tris HC升（pH为7 0.0）
4% 山梨糖醇
10 毫米氟化钠
2.5% 派法布洛克
洗涤缓冲液 2 (WB2)
的40mM的Bis-Tris HC升（pH为7 0.0）
5% 山梨糖醇
10 毫米氟化钠
2.5% 派法布洛克
洗涤缓冲液 3 (WB3)
的35mM的Bis-Tris HC升（pH为7 0.0）
6% 山梨糖醇
10 毫米氟化钠
2.5% 派法布洛克
增溶 BTH 缓冲液(SB)
的25mM的Bis-Tris HC升（pH为7 0.0）
20% 甘油
10 毫米氟化钠
2.5% 派法布洛克
α-DDM
200 mM 蒸馏水储备液
洋地黄皂苷（200 mM 蒸馏水储备液）
D溶解毛地黄皂苷需要在 92-95°C 下加热 10-12 分钟。
如果原液冷冻以备进一步使用，则需要类似的热处理才能再次使用。
100 mM α-DDM 工作溶液
的25mM的Bis-Tris HC升（pH为7 0.0）
20% 甘油
10 毫米氟化钠
2.5% 派法布洛克
200 mM α-DDM
每次都需要重新制作此解决方案。
100 mM 毛地黄皂苷工作溶液
的25mM的Bis-Tris HC升（pH为7 0.0）
20% 甘油
10 毫米氟化钠
2.5% 派法布洛克
200 mM 毛地黄皂苷
每次都需要重新制作此解决方案。
加载缓冲区(LB)
5% serva 考马斯蓝 G
750 mM 氨基己酸
的50mM的Bis-Tris HC升（pH为7 0.0）
35%蔗糖
运行缓冲液(RB)
50 mM BisTris，pH 6.8
50 mM Tricine
软染色溶液
7%醋酸
10%乙醇
83% 蒸馏水
丙烯酰胺 40% (w/v) 溶液 A（即用型）(ThermoFischer)
丙烯酰胺 2% (w/v) 溶液 B（即用型）（ThermoFischer）
阴极 SDS 缓冲液(CB)
0.1 M 三角
0.1 M 三辛胺
0.1% (w/v) SDS
阳极 SDS 缓冲液(AB)
0.2 M Tris，pH 8.9

致谢

该项目已根据 Marie Skłodowska-Curie 赠款协议 2020 获得欧盟地平线 2020 研究和创新计划的资助。675006 给 PB 和 SJ（于默奥大学），瑞典研究委员会 (VR) 和 Kempe 基金会给 SJ（于默奥大学），卡尔·特里格斯基金会科学研究 CTS 19:324）给 DF 和 WPS（于默奥大学）。我们还要感谢 Eva-Mari Aro 教授和 Roman Kou ř il教授的有益讨论。

利益争夺

作者声明没有冲突或竞争利益。

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