材料和试剂

1. 带 PTFE 帽的Pyrex TM管（Fisher Scientific，目录号：10004654）
2. 玻璃移液管和手动泵（Fisher Scientific，目录号：11546963）
3. 1毫升玻璃注射器（气密系列 1000 ; Hamilton，目录号：81320）
4. PTFE 玻璃瓶盖（Agilent Technologies，目录号：5182-0719）
5. 玻璃瓶（Dutscher，目录号：090971）
6. 50毫升圆底烧瓶（Fisher Scientific，目录号：CG150689）
7. 玻璃漏斗（DWK Life Sciences，目录号：213514609）
8. 2毫升玻璃小瓶（Sodipro，目录号：2108081）
9. 冷冻干燥的生物质古
10. 沙子（VWR，目录号：27460.364）
11. 玻璃棉（Fisher Scientific，目录号：12373866）
12. Celite TM （ACROS Organics ，目录号：349675000）
13. 硅胶Geduran的Si 60 ® （Merck公司，目录号1.11567）
14. 盐酸37％（盐酸; Fisher Scientific公司，目录号：10294190）
15. 将去离子水（H 2 O）
16. 甲醇（MeOH ；ACROS Organics ，目录号：364390025）
17. 二氯甲烷（DCM；ACROS Organics，目录号：326850025）
18. 丙酮（ACROS Organics，目录号：444150050）
19. 正庚烷（Hept；ACROS Organics，目录号：364360025）
20. 异丙醇（或丙-2-醇；IPA；ACROS Organics，目录号：184130250）

设备

烤箱（高达 450°C）
真空泵（爱德华兹V acuum，目录号码：A34317984 ）
注意：在这里，我们使用了一个真空泵在50赫兹与20.5 m的最大位移3 ħ -1 ，17.0 m的最大排气速度3 ħ -1 ，和2×10的极限真空-2毫巴。虽然强大的吸力可以加快程序，但可以使用任何能够达到低于 20 毫巴的极限真空的真空泵。
旋转蒸发器（Büchi公司，型号：旋转蒸发器RE 111;加热浴，B-491）
注意：可以使用任何与您的真空泵和加热浴兼容的旋转蒸发仪，最高可达 50°C。
N 2干燥系统
注意：在这里，我们将建筑物 N 2供应（空气产品公司，CryoEase ®供应系统）连接到由聚碳酸酯管（Cole-Parmer，目录号：FV-30526-18）和分流阀（Cole-Parmer，目录号：FV-30600-02）以针（BD，目录号：300700）或玻璃移液管结尾。有关系统的描述，请参阅图 3。
高效液相色谱仪
注：在这里，我们使用配备有二元泵（安捷伦G1312A），溶剂脱气装置（安捷伦G1379A），自动注射器（安捷伦G1913A），恒温的柱室（安捷伦G1316A）一台HP 1100系列液相色谱系统，和化学工作站色谱管理器软件（安捷伦科技修订版 A.09.03）。然而，任何HPLC系统可以用于用溶剂梯度的功能。
Prevail Cyano 3 微米色谱柱（150 mm × 2.1 mm；Grace Davison Discovery Sciences，VWR ，目录号：HICH99243）
注意：不使用时，我们的色谱柱储存在 Hept/IPA (95:5, v/v) 中。然而，溶剂混合物可用于存储和柱的平衡两者并因此依赖于分离梯度（见小号TEP d 4）。因此，它可能会根据您的要求进行调整。
配备离子阱和大气压化学电离 (APCI) 源的质谱仪
注意：这里，我们使用了离子阱 MS Esquire 3000Plus（Bruker Daltonics，GE0100-G552）和安捷伦 APCI离子源（Agilent G1947A），但任何配备 APCI 离子源的MS 仪器都可以使用。

软件

质谱和色谱处理软件。
注：在这里，我们采用了布鲁克·道尔顿提供的指南针数据分析软件（版本5.0，2017年），但任何质谱和色谱处理软件，尤其是你的HPLC-MS仪器制造商提供的一个，都可以使用。
程序

材料准备
古菌生物质必须事先冷冻干燥。
注意：甲S表示每脂质提取过程中，生长培养基中可以包含脂质无关，待分析的细胞的量显著。为了避免从培养基中提取这些脂质，在冷冻干燥之前用适当的等渗溶液冲洗细胞两次是很重要的。
使用前将所有玻璃器皿、沙子、硅藻土和玻璃棉在 450°C 下燃烧 4 小时，以去除所有潜在有机污染物的痕迹。用去离子水，丙酮，和DCM（按该顺序）的玻璃器皿。使用前让其干燥。
硅胶在索氏装置中用 DCM 预萃取。
所有试剂和溶剂（除庚烷）必须是高品位，即。, > 99% 纯度，以降低污染风险。
注意：高纯度溶剂也可以通过蒸馏如果可能获得。
Hept 通过在填充有硅胶的柱子上过滤来清除有机污染物。
制备100毫升，加入10的1.2N HCl的MeOH溶液的毫升的盐酸37％至90毫升MeOH中。
注意：该溶液可以在室温下在带盖的玻璃瓶中储存数周。
制备100 ml的的MeOH / DCM（1：1，V / V）加入50 ml的DCM中于50 ml的MeOH中。
注意：该溶液可以在室温下储存在带盖的玻璃瓶中数周。
将 0.5 ml IPA 添加到 49.5 ml Hept 中，制备 50 ml Hept/IPA (99:1, v/v)。
注意：该溶液可以在室温下在带盖的玻璃烧瓶中储存数周。
通过将 50 毫升 IPA 添加到 950 毫升 Hept ，制备 1 , 000 毫升 Hept/IPA（95:5，v/v）。
注意：该溶液可以在室温下在玻璃瓶中储存数周。
准备一个装有 Hept的 1 , 000 毫升玻璃瓶。
注意：该溶液可在室温下保存数周。

古菌细胞水解（图1）
转移古细菌细胞沉淀到在Pyrex TM使用小玻璃漏斗玻璃管中。
使用 4 ml 1.2 N HCl 的 MeOH 重新悬浮古菌细胞沉淀，并使用玻璃移液管和手动泵冲洗玻璃漏斗。
注意：这一步的体积可能会根据细胞颗粒的大小进行修改。但是，不要将 Pyrex TM管填充到其总体积的一半以上。
用带有 PTFE 密封件的盖子紧紧关闭 Pyrex TM管。
注意：仔细检查盖子是否关闭，以避免任何可能导致样品破坏的蒸发。
为了避免样品和污染的任何交叉污染烘箱中泄漏的情况下，放5厘米砂的在玻璃瓶中，将您的Pyrex TM管中的砂，并关闭瓶用塞子。
在 110°C 下加热样品 4 小时。
注意：此方法是强大到足以除去大部分古极性头组没有进一步恶化古脂质，即，醚键仍然安然无恙。
将样品从烤箱中取出，让它们冷却至室温。
注意：在这一步，如果您的试管密封不够严密，您的样品可能已经变干并完全燃烧（样品呈黑褐色），这可能会导致核心脂质的破坏。甲S上的过程的质量控制，Ç赫克该管还含有溶剂和细胞沉淀几乎完全破坏和无色的。

图 1. 古菌干生物质直接酸甲醇分解的工作流程示意图。带圆圈的数字是指文本中的步骤。缩写：MeOH，甲醇；聚四氟乙烯，聚四氟乙烯。

核心脂质提取（图2）
样品冷却后，小心地打开 Pyrex TM管。
警告：由于在加热步骤中产生的气体，热气体和液体可以在打开时它从管涌出。
将 4 ml DCM 添加到 Pyrex TM管中（最终 MeOH/DCM 1:1，v/v）。
注意：这一步的体积可能会根据细胞颗粒的大小进行修改。
通过将玻璃棉和硅藻土放入玻璃漏斗中来创建过滤器。将玻璃漏斗放在适合旋转蒸发仪的 50 ml 圆底烧瓶上。
将样品转移到过滤器上，并通过漏斗将其过滤到烧瓶中，以去除脂质提取物中的固体颗粒（即细胞碎片）。
冲洗的Pyrex TM （：1,1用4ml的MeOH / DCM的管两次V / V ），并将其过滤到同一烧瓶如上。
用4ml的MeOH / DCM的冲洗过滤器进入相同的烧瓶两次（1：1，V / V ）。

图 2. 从水解生物质中提取核心脂质的工作流程示意图。带圆圈的数字是指文本中的步骤。缩写：MeOH，甲醇；DCM、二氯甲烷。

HPLC 分析的样品制备（图 3）
使用设置为40°C的旋转蒸发器在减压下干燥样品。
冲洗烧瓶用MeOH并在减压下再次干燥以允许剩余的HCl / H的完全蒸发2 O.
干燥后，用 0.5 ml Hept/IPA (99:1, v/v )小心溶解烧瓶中的内容物，以回收核心脂质并使用玻璃注射器转移到 2 ml 小瓶中。
再冲洗烧瓶 3 次，然后转移到 2 ml 小瓶中。
干燥的N蒸汽下的样品2 。
在HPLC 分析之前，将样品重悬到 1 ml Hept/IPA (99:1, v/v ) 中。
注意：脂质提取物可以在 -20°C 下长时间（即几年）储存。

图3.工作流用于HPLC分析的核心脂质提取物制备的示意图。带圆圈的数字是指文本中的步骤。缩写：MeOH，甲醇；庚，庚烷；异丙醇，异丙醇。

HPLC-MS 核心脂质分离和分析
注意：本节基于 Tourte 等人，2020 年，但可以调整溶剂的性质和体积以适应您的色谱分离要求，即色谱柱的性质和大小。
启动您的色谱仪。
将色谱柱恒温器的温度设置为 30°C。
清空垃圾收集器并填充用于冲洗的小瓶 (Hept/IPA 95:5, v/v)。
使用用于 HPLC 色谱的梯度馈送色谱管理器软件。
注意：这里，我们使用了以下梯度，A = Hept/IPA (95:5, v/v) 和 B = Hept，流速为 0.2 ml min -1 ：95% B（5 分钟等度）在 30 分钟内（5 分钟等度）升至 65% B，然后在 1 分钟内升至 0% B（10 分钟等度），然后在 1 分钟内升至 95% B（5分钟等度洗脱）。每个样品的总运行时间为 57 分钟。
仔细检查系统中的压力是否稳定，以确保正确分离。如有必要，请刷新您的系统。
启动 MS 仪器。
为 MS 管理器软件提供 MS 分析条件。
注意：这里，我们使用了以下 MS 条件：雾化器压力 50 psi，APCI 温度 420°C，干燥温度 350°C，干燥气体 (N 2 ) 流量 5 L min -1 ，毛细管电压-2 kV，电晕 4 µA，扫描范围 m/z 600-2 , 200。
仔细检查所有参数是否正确达到设定值。
将包含溶解于1ml庚烷/ IPA的您的样品2毫升小瓶（99：1，V / V;参见小号TEP C6 ）到HPLC自动进样器。
用您的样品信息和序列填充色谱管理器软件文件。
注意：进样量设置为 10 µl。为了提高可重复性，调整样品（浓度小号TEP C6 ），而不是改变的注射体积。
运行您的程序。
笔记：每 30-40 次分析运行一个控制样本，以检查适当的分离和强度。通过运行一式两份或三份选定的样品和参考样品来评估再现性。例如，作为参考样品，我们使用了来自 Pyrococcus furiosus 的核心脂质提取物，其中包含二植烷基甘油二醚 (DGD) 和四醚脂质的多种异构体，即甘油单、二和三烷基甘油四醚 (GMGT、GDGT、和 GTGT，分别具有 0 到 4 个环戊烷环，以评估 HPLC 色谱柱的性能。此外，运行标准混合物（合成古菌类脂质可以从 Avanti 购买）以评估检测到的化合物的相对响应因子。作为标准混合物，我们使用摩尔比为2:1的 DGD/GDGT0 溶液，这给出了 DGD 的相对响应因子约。10倍低于我们的分析条件下GDGT0的（Tourte等人，2020）。

色谱图和质谱分析
注：古核心脂质质量的例子相对较少光谱已公布，但标识可以帮助参照例如，Hopmans等。( 2000 ) 。
使用质谱和色谱处理软件绘制分析的总离子流 (TIC)。
主要化合物，即TIC 上丰度最高的化合物，根据其质谱图、碎裂模式、LC 中的保留时间以及与已公布数据的比较（如果可能）进行初步鉴定。使用给定核心脂质峰的几个光谱的平均值，以确保正确识别（图 1）。
注：非常FE瓦特除了完整化合物的质子化加合离子是由我们APCI过程生成的化合物，和因此被鉴定基于其质子化质量。为了进一步确定已鉴定的核心脂质的结构，可以执行 MS/MS。
绘制的提取离子色谱图（EIC）通过提取识别的所有化合物的质量（图4）。对于每种化合物，选择适合您的 MS 系统的质量范围。
注意：考虑到我们的系统，我们通常使用 ±0.5 的质量范围。
在您的EIC整合各峰，以确定你的分析条件下每个核心的脂质的相对比例和与正确的化合物的响应系数（参照小号TEP D11 ）。

图 4.嗜酸嗜热球菌的核心脂质分析。细胞在最佳条件下生长（85°C，pH 9.0，3.0% NaCl (w/v)；Dirmeier等，1998）。通过提取以下质量数绘制色谱图：653.5、1302.5 和 1304.5。插入物示出了质谱和每个彩色峰所得到的核心结构：绿色，diphytanyl甘油二醚（DGD）; 蓝色，无环戊烷环的甘油三烷基甘油四醚 (GTGT0)；紫色，不含环戊烷环的甘油二联植烷基甘油四醚 (GDGT0)。指示的质量对应于质子化加合物。校正在我们的分析条件下观察到的响应因子，DGD、GTGT0 和 GDGT0 的相对比例分别为46%、1% 和 53%。

致谢

笔者想感谢法国国家研究署资助的项目ArchaeoMembranes（ANR-17-CE11-0012-01）和CNRS我nterdisciplinary程序“ORIGINES”资助的研究项目。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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