材料和试剂
1. 8支低轮廓管（0.2M的条升）与扁平帽（赛默飞世尔科技，产品目录编号AB-0776 ），存储在RT
2. 96深孔板（Mettler Toledo，目录号：LR-P2-96P）
3. 纯粹的速度PS提示20分之1000 微升IMAC 12-PK PT-10-N20的Ni-IMAC 树脂，12×1,000 微升的提示（Mettler Toledo的，目录号：PT-10-N20，米aterial 号：17012572 ），储存在4°C
4. 5毫升锥形管（Thermo Fisher Scientific，目录号：Corning 352063 ，在RT存放）
5. Amicon Ultra-2离心过滤器单元（10k色谱柱；Millipore-Sigma ，目录号：UFC201024），在室温下存放
6. 0.6毫升SnapLock 微管非无菌MaxyClearMaxymum 回收液（Axygen ，目录号：MCT-060-V）
7. DH5a-T1-R感受态细胞（Thermo Fisher Scientific，目录号：12297016 ），在-80°C下存储
8. LeftRight （LR）克隆酶混合液（Thermo Fisher Scientific，目录号：11719019 ），在-80°C下储存
9. DMSO （Sigma-Aldrich，目录号：D8418-50ML ），储存在-20°C
10. 环炔烃5'修饰的100 bp DNA寡核苷酸（表1 ，Eurofins，卢森堡，定制），储存在-20°C下
11. 1 μ 克/ 微升HaloTag-Proein G（上总DNA研究所，日本千叶的ProteinG -His ，保存于-80℃ ）
12. HaloTag 融合蛋白的质粒模板DNA （定制，请参见步骤A和B），储存在-20°C
13. Plusgrow II 用于微生物培养（Nacalai Tesque ，目录号：08202-75 ），在4°C下储存
14. 带有分解代谢抑制（SOC）培养基的超级最佳肉汤（Thermo Fisher Scientific，目录号：15544034），在4°C下储存
15 甘油（FujiFilm ，目录号075-00616）
16. QIAprep Spin Miniprep试剂盒（Qiagen，目录号：27104 ），存放在室温下
17. 转录和翻译（TNT）T7偶联的小麦胚芽提取试剂盒，用于体外表达（Promega，目录号：L4140），储存在-80 °C
18. RNasin RNase抑制剂（Promega，目录号：N2511 ），储存在-20 °C
19. Magne HaloTag 磁珠（Promega，目录号：G7281），存储在4 °C下
20. 5 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）（Dojindo ，目录号：347-07481），在室温下存放
21. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）片剂pH为7.4（TA ķ 一个ř 一个，目录号：T9181），存储在RT
22. Tween-20（Nacalai Tesque ，目录号：23926-35 ），在RT存放
23. PBST （PBS Tablets pH 7.4，Ta k a r a，目录号：T9181 和Tween-20，Nacalai Tesque ，目录号：23926-35 ），在室温下存放
24. HaloTag 琥珀酰亚胺酯（O4）配体（Promega，目录号：P6751 ），储存在-80 °C
25. Precision Plus Protein TM 双色标准液（Bio-Rad，目录号：1610374），储存在-20 °C
26. 强大的Amp DNA聚合酶PCR（Takara，目录号：R071A ），储存在-20 °C
27。 SPRI磁珠（Beckman Coulter，目录号：A63880 ），在4 °C下存储
28. 磷酸二氢钠二水合物（NaH 2 PO 4 ，和光，目录号：192-02815，在RT存放）用于1 M NaH 2 PO 4
29. 1 M Na 2 HPO 4的磷酸氢二钠12-水（Na 2 HPO 4 ，Nacalai Tesque ，目录号：31723-35 ，在室温下储存）。
30. 咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：I2399）
31. 氯化钠（NaCl ；Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9759）
32。预制5 - 12.5％十二烷基硫酸钠（SDS） -聚丙烯酰胺XV - 潘多拉凝胶（DRC，东京，产品目录号：NXV-212），储存在4 ℃下
33. GelRed 核酸染色剂（Biotium ，目录号：41002），保存在室温下
34. HaloTag TMR配体（Promega，目录号：G8251），储存在-20 °C
35. RNase Free Water（Thermo Fisher Scientific，目录号：10977015），在RT处存储
36. 聚乙二醇（PEG）8000 （Promega，目录号：V3011），在RT处存储
37。用ddH 2 O从100％乙醇（Nacalai Tesque ，目录号：09666-85）中稀释80％乙醇，储存在室温下
38. Qiagen洗脱缓冲液（EB缓冲液，Qiagen，目录号：19086），存放在室温下
39. QIAquick 凝胶提取试剂盒（Qiagen，目录号：28704），在室温下存放
40. 图书馆定量试剂盒（Takara Bio，目录号：638324），将主混合物存储在4°C，将酶存储在-20 °C
41. 高灵敏度DNA试剂盒（安捷伦，目录号：5067-4626），小号在4℃撕试剂，并在室温的实验室芯片
42. 氨苄青霉素小号裂果盐（ナTesque公司，目录号：02739-32），保存于4℃下
43. MiSeq 试剂盒v3-150循环（Illumina ，目录号：MS-102-3001），在4°C下储存
44. Azido- HaloTag 配体AzHLT-1（定制，请参见食谱），储存在-20°C
45. 10 μ 中号正向引物索引，10 μ 中号反向索引引物用于文库制备（见配方和表2中，欧陆，目录号：定制），储存在-20 ℃下
46. HaloTag 融合蛋白的质粒模板DNA （请参见食谱）
47. Plusgrow II（请参阅食谱）
48. 氨苄西林（请参阅食谱）
49. Azido- HaloTag 配体AzHLT-1（请参阅食谱）
50. 一种反应的体外表达（IVX）混合物（请参阅食谱）
51. 缓冲区A2（请参阅食谱）
52. 缓冲区B2（请参阅食谱）
53. 1 M咪唑（请参阅食谱）
54. PBS缓冲液（请参阅食谱）
55. PBST（请参阅食谱）
56. 稀释缓冲液（请参见配方）
57. HaloTag TMR配体（请参阅食谱）
58. 50％PEG（请参阅食谱）
59. 500 µM 环炔修饰的100 bp DNA寡核苷酸（请参见食谱）
60. 用于库制备的正向和反向索引引物（请参见食谱）

设备
培养箱中培养大肠杆菌崇拜URE（预设为37℃，TAITEC，型号：BioShaker BR-11UM）
冷冻离心机（T OMY，型号：MX - 201）
热循环仪（Bio-Rad，MyCycler ，目录号：1709701EDU）
用于qPCR的热循环仪（Roche，型号：LightCycler 480，目录号：05015278001 ）
纳米滴仪（赛默飞世尔科技，纳米d ROP ，目录号码：ND1000）
用于蛋白质表达的培养箱（预设为30°C，TAITEC，型号：杂交培养箱HB80）
电泳室（DRC，XVA Pantera 系统，型号：NXV-HM2Bset）
纯转速p S / E4多启动套件PT-S10-E12（E12-1200XLS多道移液器和附件工具箱：基部，SD卡，96深孔板，ColorTrak TM 克UIDE，和尖端适配器，Mettler Toledo的，材料号：17013547 ）
Eppendorf T hermomixer摇床（Eppendorf，目录号：22670506）
麦格纳展位（日本遗传学，快速基因，目录号：FG-SSMAG2）
生物分析仪（安捷伦，型号：Bioanalyzer 2100，目录号：2100）
MiSeq 系统（Illumina，目录号：SY-410-1003）
VORTEX-GENIE 2 （科学工业，目录号：68316797 ）
荧光图像分析仪（FujiFilm ，型号：F LA3000，目录号：FLA3000）

程序
该过程提供了一步一步的指示HaloTag -融合蛋白的表达，分子条形码HaloTag -融合蛋白，并用条形码蛋白质-蛋白质相互作用的检测（图1 ）。

图1. HaloTag 条形码检测程序流程图。左侧的标记表示完成每个步骤所需的时间。制备HaloTag 表达克隆（步骤1 - 在使用前预先和配体-DNA复合物（步骤21-22）13）。由于试剂仅包含DNA和化合物，因此它们不需要特殊的存储条件（-20 °C ）。在使用前立即准备HaloTag 融合蛋白。我们没有测试的保质期HaloTag 融合蛋白（步骤14 - 20）和纯化蛋白质的条形码（步骤26-40）。我们建议您在几个月内使用条形码蛋白。

HaloTag 融合制备DNA克隆
克隆到pENTR中的ORF可以从拟南芥生物资源中心（ABRC ，here）获得，每个pENTR 克隆的价格为13 美元（Yazaki et al。，2018）。然后将pENTR 克隆与定制设计的HaloTag 表达载体pIX-His-Halo：ccdB 重组，该载体衍生自pIX-Halo：ccdB （Yazaki 等人，2016年; 此处可用）。注意的pENTR 克隆，在上面列出的链路，被命名的pENTR-S网络连接和载体pENTR -TOPO和包含壮观霉素和卡那霉素抗性基因，分别。用HaloTag 融合载体对克隆进行重组，以构建条形码蛋白。但是，该程序可以应用于来自其他生物（例如人和小鼠）的HaloTag -ORF融合克隆。
用于单个反应的试剂（从标准Gateway克隆反应中修改）
1 μ 升5×缓冲液（Invitrogen，卡尔斯巴德，CA，USA）
1 μ 升pIX的载体DNA（100毫微克/ 微升）
1.5 μ 升TE缓冲液
0.5 μ 升LR 克隆酶酶（Invitrogen）中
子吨otal体积：4 μ 升每单个LR重组反应
吸管4 μ 升从小号TEP 2到升流简档管（0.2M 升）。
加入1 μ 升的pENTR 克隆DNA（50毫微克/ μ 升）到每个管
最终吨otal体积：5 μ 升每单个LR重组反应
短暂密封并涡旋混合内容物。然后短暂离心以收集样品。
将密封管在室温下孵育过夜。

转型
解冻DH5α-T1-R感受态细胞在冰上和等分试样10 μ 升每管细胞（低轮廓管）使用移液管。
加入1 微升的LR重组反应以等分的感受态细胞（不吸管向上和向下）。通过在工作台上轻击管子几次进行混合。在冰上孵育30分钟。
在加热块中于42 °C加热冲击电池45 s。将细胞放在冰上约2分钟。
向每支试管中加入100μlSOC 。添加之前，应将SOC 预热至37 °C 。摇晃或不摇晃，于37°C孵育1小时。
接种50 微升来自转化混合物的小号TEP 10到3ml的Plusgrow II氨苄青霉素在5毫升的锥形试管接种培养和在37℃下过夜摇动。
准备转化体的冷冻甘油储备。吸移管300 微升50％的甘油，以每个空吨的UBE。从步骤11中添加700μl 过夜培养物，并通过上下吹打均匀混合。甘油库存应储存在-80°C。
按照制造商的建议，使用Qiagen Miniprep Kit从剩余的培养物中提取质粒DNA 。
HaloTag 融合DNA和蛋白质的制备
离心机在1对5-ml锥形管接种，500 × 克在室温（25 ℃）下进行10分钟以沉淀细菌细胞。
将下清液倒入通风室下，打开盖子，在工作台上干燥试管。
按照制造商的建议，使用Qiagen Miniprep Kit从细菌细胞沉淀物中纯化质粒DNA 。
使用Nanodrop测量DNA浓度。预期的浓度应为约700纳克/ μ 升。
继续使用IVX mix进行蛋白质表达。IVX是一种体外蛋白质表达系统，该系统使用偶联的转录和翻译反应从DNA模板表达蛋白质，而无需真核细胞或原核细胞。该HaloTag -融合蛋白的查询使用TNT系统单独表达（见配方5 IVX混合）。该IVX组合应立即使用前准备。
将试管与IVX混合物在30 °C下孵育2小时。
冻结并储存在-80 °C
配体-DNA复合物和条形码HaloTag融合蛋白的制备
制备500 μ 中号由条形码DNA寡核苷酸与5'修饰dibenzocyclooctyne （DBCO）在不含RNA酶的水（表1和配方14 ）。制备500 μ 中号叠氮基HaloTag 配体，AzHLT-1（配方4 ）。

表1. 环炔修饰的100-bp DNA寡核苷酸。该表改编自Yazaki 等。（2020）。条形码DNA由Eurofin 合成为单链DNA，具有由二苯并环辛炔（DBCO）修饰的5 ' 和3 ' 修饰的四甲基罗丹明（TMR）。

混合2 微升的500 μ 中号DNA（表1）和0.5 微升的500 μ 中号叠氮基HaloTag 配体AzHLT-1（4：1），并培育在室温1个小时（点击反应）。该混合物的成分的最终浓度是400 μ 中号DNA和100 μ 中号HaloTag 配体。
结合100 μ 升的HaloTag 融合在步骤20中获得的具有1蛋白质μ 升在RT从步骤22 DNA-配体混合物的。单独地，将1 μ 克的HaloTag 蛋白G用1 微升的DNA配体混合用于缀合的控制。
在室温下孵育1小时。
通过使用5个SDS-PAGE确认DNA-蛋白缀合- 12.5％梯度凝胶（图2）。结合产物的大小应大于非条形码蛋白质的大小。DNA缀合的蛋白质（10 μ 升; reactio的总量的〜10％Ñ 101 微升）进行加载。非条形码蛋白（2.5 μ 升：输入的2.5％）上样作为阴性对照（泳道B1 - B5，B6 - B10），以指示与原始蛋白质的大小。使用TMR修饰的DNA条形码对HaloTag 蛋白进行染色的结果如图2 所示（泳道A1 - A5，A6 - A10）。的蛋白质-DNA缀合显示的大小更高的分子量在图2 （泳道A1 - A5，A6 - A10）相比HaloTag 根据TMR配体在染色蛋白无偶联的DNA条形码图2 （泳道B1 - B5，B6 - B10）。使用荧光图像分析仪（FujiFilm ，FLA3000），基于TMR在532 nm处的荧光将染色的蛋白质可视化。

图2.蛋白-DNA缀合结果处理了体外表达的粗蛋白。使用二苯并环辛炔-TMR染色和与TMR缀合的DNA寡核苷酸条形码检测泳道A1 - A10，与DNA缀合的HaloTag- 蛋白。使用TMR配体染色检测泳道B1 - B10，HaloTag- 蛋白。L道，分子梯。将所有蛋白质与DNA条形码和叠氮基配体AzHLT-1以1：1：2的比例（摩尔/摩尔/摩尔；泳道A1 - A10）混合，并在室温下孵育1小时。蛋白质：1，At1g32640（68 kDa ）；2，At2g36270（47 kDa ）; 3，At3g08500（38kDa ）；4，At4g17870（22 kDa ）; 5，At1g71930（37 kDa ）; 6，At3g62420（17 kDa ）; 7，At5g28770（34 kDa ）; 8，At5g62380（40 kDa ）; 9，At1g12260（46 kDa ）; 10，At2G40330（24 kDa ）。P rotein大小而不指定HaloTag （33 kDa的）。蛋白质的识别号码对应于先前分配的拟南芥基因的识别号码（矢崎等人，2016）（https://www.arabidopsis.org /）。右侧面板（蛋白质6 - 10）从的补充图S3改性矢崎等人。，2020年。

净化DNA- HaloTag 从步骤24使用的融合蛋白（条形码蛋白）组氨酸标签纯化试剂盒（纯转速p S / E4多入门套件和1000年至1020年μ 升在RT（图IMAC提示）3）。将ColorTrack 导板放置在平台下方，深孔板在上方对齐（图3A）。将深孔板放在平台上，然后将其沿Pure Speed P S / E4多功能入门套件的平台导轨滑入到位（图3B）。
10个条形码蛋白质纯化，使用E12 - 1200XLS多道移液器500添加μL 缓冲液A2（配方7 ）至孔A2 - （在图的行平衡在96深孔板中进行柱平衡A11 3A，3 B）。加1 ，100 μ 升缓冲液A2到B2的孔- B11捕获样本（在图捕获行3A，3 B）。加入500 μ 升缓冲液A2到孔C2-C11以洗涤样品（1个ST 洗涤行在图3A，3 B）。加入500 μ 升缓冲液A2至D2井- D11以洗涤样品（2 次在图洗行3A，3 B）。添加〜100 μ 升缓冲液B2到E2的孔- E11以洗脱纯化的样品（在图洗脱行3A，3 B）。制备板后，添加所有条形码的蛋白质样品（101 μ 升或休息的所有样本的来自步骤）24 立即（在图捕获行开始纯化之前井B2-B11 3A，3 B）。
加载PURESPEED 树脂提示（PS提示二十○分之一千微升IMAC ）对E12-1200XLS多道移液器（图信道号2-11 3C）。
加载所述两个适配器尖端（蓝色适配器PS提示二十○分之一千微升IMAC ）至信道号1和12，其毗邻所述外树脂尖端上E12-1200XLS多道移液器以固定吸液管组件（图3C）。
将带有12个已装载吸头的E12-1200XLS多通道移液器放置在96深孔板的A1-12孔（平衡行）中以进行柱平衡（图3D）。
选择IMAC 1000/20默认程序μ升上E12-1200XLS多道移液器。组氨酸标签纯化的程序包含树脂平衡（图3D），捕获（图3E），洗涤（图3F，G）和序列洗脱（图3H）。
按下E12-1200XLS多通道移液器上的CONT键，开始纯化过程，并按照多通道移液器屏幕上给出的说明进行操作。此步骤可消除未与蛋白质偶联的过量条形码DNA，配体和条形码-配体复合物。

图3. DNA- HaloTag 融合蛋白的纯化。A. 将ColorTrack 导板放置在平台下方，深孔板在上方对齐。B. 将深孔板放在平台上，然后沿平台的导轨将其滑入到位。C. 加载PURESPEED 树脂提示，以信道号2 - 在移液管11。加载所述两个适配器尖端（蓝色适配器）连接到信道号1和12 D. 将与在孔A1 12个加载提示所述移液管- 96深孔板的用于柱平衡12（平衡行）。选择IMAC 1000/20默认程序微升的多道移液器。组氨酸标签纯化程序包含该序列。E. 在孔B1-12中捕获。F. 第一次洗涤在井C1 - 12 。G. 第二次洗涤在孔D1 - 12 H. 在井E1样品的洗脱- 12。

透析程序。将Amicon Ultra-2 10k色谱柱设备插入滤液收集管。
将所有纯化的条形码蛋白吸管到Amicon -ultra 10k色谱柱中，并在色谱柱中加入1x PBS，直至2 ml。用收集管盖住色谱柱。
将用10k色谱柱覆盖的滤液收集管放入离心机转子中。将列中的薄膜面板对准转子的中心（一个面板朝上，另一个面板朝下）。确认由滤液收集器，过滤器柱和收集管组成的装置位于转子的底部。确保收集管的边缘完全位于转子壁内。确保转子与第二根色谱柱装置保持平衡，第二根色谱柱装置与第一根色谱柱直接相对。
离心机在4 ，000× 克于4 ℃下20-30分钟。
取下滤液收集管。倒置过滤柱和收集管。
将带有过滤器柱的收集管放入离心机中。确保转子与第二根色谱柱装置保持平衡，该装置直接位于第一根色谱柱的对面。
离心1 ，000× 克在4 ℃下2分钟，以传送从过滤柱浓缩和透析蛋白质到收集管中。最终浓缩物体积为在30 - 60 μ 升。对于大多数ORF，由TNT产生的蛋白质水平和结合率是恒定的（Yazaki 等人，2016年和2020年以及图2）。因此，没有必要使用SDS-PAGE检查所有纯化的结合物。
冷冻并在-80 °C下保存样品（无需速冻）。
检测蛋白质与条形码蛋白的相互作用
吸管5 微升HaloTag 玛格纳珠成200- 微升PCR管中。用Magna Stand 上的1x PBST将珠子洗3次。10添加微升的PBST 到洗涤珠。
添加9 μ 升来自步骤诱饵蛋白的20至含10管μ 升的珠19的总体积μ 升。抖动在EppendorfŤ hermomixer在1摇床上，在000rpm下6 ° c ^ 1个小时。
洗涤珠80三次μ 升PBST上的玛格纳立场。添加10 μ 升的PBST 到洗涤诱饵珠。
加入5 μ 升来自步骤39的查询条形码蛋白与含有10管μ 升的诱饵珠15的总体积μ 升。抖动在EppendorfŤ hermomixer摇床上在1 ，在000rpm下6 ℃下1个小时。
用PBST在Magna Stand 上洗三遍。10添加微升的PBST 到洗涤诱饵珠。
冷冻并在-80 °C下保存样品。
用于检测蛋白质间相互作用（PPI）的文库制备
对反应中包含的珠子进行定量PCR （qPCR），以确定样品的浓度。使用以下引物对：
引物1：5 ' - ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - 3 '

引物2：5'- GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT -3'

qPCR的引物设计用于以下条件：在95°C下5分钟，在95°C下30 s的35个循环，在60°C下45 s。将样品保持在4 °C。在不进行TMR修饰的情况下，使用200 pM ，20 pM ，2 pM 和0.2 pM 的Oligo01（表1），基于标准曲线计算样品浓度。
涡旋步骤46中的样品。根据步骤47中qPCR的结果，使用稀释缓冲液（配方11 ），每2μl 样品中有12,000个分子带有珠子。即，要获得12,000个分子，请遵循以下稀释条件；
根据步骤47的结果准备1 pM 的条形码蛋白。
接下来，将步骤A中的1 pM 样品稀释100倍以制备0.01 pM 的蛋白质。
移液管2 微升0.01的PM 蛋白质的12000个分子。
准备用于所有样品反应的PCR预混液。接下来，将反应混合物等分到每个试管中。
对于一个反应；
12.5 微升2× MightyAmp 缓冲
0.5 微升MightyAmp DNA聚合酶
8.5 微升不含RNA酶的水
吸取21.5 微升到每个管中。
加入0.75 微升的10 μ 中号正向引物指数和0.75 微升的10 μ 中号表2反向索引引物到每个管中。

表2. 用于蛋白质索引和计数文库制备的引物序列。索引序列带有下划线。该表改编自Yazaki 等。（2020）。

添加来自步骤49的12,000分子/ 2μl 样品和珠。涡旋并通过以100 xg离心5 s 离心下来。
将试管放入Bio-Rad热循环仪中并运行以下参数：
98 °C ，2分钟
：1个周期
98 °C ，10秒
60 °C ，10秒
68 °C ，1分钟
：4个循环
98 °C ，10秒
60 °C ，2秒
68 °C ，1分钟
68 °C ，5分钟
：25个周期

循环完成后保持在4 °C
在完成步骤52 之前30分钟，准备AMPure XP珠子。
准备PEG / NaCl溶液：
44 微升50％PEG
75 微升5 M氯化钠

1 微升不含RNA酶的水

最终10％PEG，1.7 M NaCl
用移液管吸取25μl 无RNase的水至1.5 ml管中。
从样品的添加所有小号TEP 52到1.5-ml管（总体积50 微升）。
添加120 微升PEG /氯化钠所以lution从步骤样品56（总体积170 微升）。
涡流AMPure 珠和添加50 微升的AMPure 珠从管小号TEP 58（总体积220 微升）。涡旋，以100 × g的转速旋转5 s，并在室温下孵育5分钟。
将试管放在MagnaStand上，等待5分钟。
通过移液弃去上清液，然后加入250μl80 ％的乙醇。
通过移液弃去80％的乙醇，然后加入250μl80 ％的乙醇。
通过移液器丢弃80％的乙醇，并使其干燥。
卸下MagnaStand 和吸管23 微升Qiagen公司洗脱缓冲液（缓冲液EB）到每个管中。在室温下孵育1分钟。
将试管放在MagnaStand上，于室温孵育2分钟。
吸取20 微升从样品的小号TEP 64和转移到新的管中。
使用Bioanalyzer高灵敏度臀部模式（图4A）检查样品质量。扩增产物的大小应为174个碱基对。
注意：具有正向和反向索引的PCR引物可用于使用Mighty Amp进行PCR扩增。基于引物和所用模板DNA的数量，可能会发生非特异性扩增（图4B 黑色箭头）。为避免非特异性扩增，我们建议更改引物组合和模板DNA，因为可以获得非特异性扩增产物，而不是174 bp产物。如图非特异性扩增4B 用的引物组合观察Foward6-Reverse3于表2。为了避免这种情况，在表2中对引物Foward8-Reverse1的显示特异性扩增（图4A BLA CK箭头）。

图4. 库制备步骤中条形码DNA扩增的结果。A. PCR扩增产生一致的结果，为174-bp产物（箭头）。B. 非特异性PCR扩增的预期结果。正反组合引物对使用不当会导致扩增的意外结果（箭头）。我们建议在观察到意外的扩增结果时更改索引引物和模板DNA的对。请参阅注释部分，了解我们建议对引物进行的更改，以避免意外的扩增产物。L：分子梯。

根据使用生物分析仪获得的摩尔浓度（pmol / L），准备> 2 nM 样品混合物（如果有多对PPI ）。
使用GelRed 核酸凝胶染料和琼脂糖凝胶萃取纯化来自S tep 67 的样品混合物。从琼脂糖凝胶中切割出目标大小（174 bp）的DNA条带。按照制造商的建议，使用QIAquick 凝胶提取试剂盒从凝胶中提取DNA 。
量化从样品小号通过TEP 68 的qPCR。电子xpected浓度约为8 纳米（1-20 纳米）的平均。
准备用于PCR的预混物。
对于一个反应
1 微升样品
2 微升不含RNA酶的水
2 微升5×引物混合物
5 微升泰拉PCR直接SYBR预混料
将灯管放入LightCycler 480（Roche）中并运行以下参数：
98°C，2分钟
：1个周期
98°C，10秒
60°C，15秒
68°C，45 s
：35个周期
将样品保持在40°C

制备10 微升2 nM的从步骤68样品混合物。
测序的进展。使用MiSeq 试剂盒v3-150cycle 以76个碱基对的末端模式运行MiSeq 系统。用于测序，变性10 微升2 nM的从样品DNA混合物小号TEP 71用10 微升0.2的1N的NaOH于室温5分钟。
添加980 微升预冷的HT1于含有以下的管nM的变性文库池以制备20 PM 变性库。
使用预冷的HT1从中将变性的20 pM 文库溶液稀释至7 pM ，最终体积为600μl 。
将准备好的文库加载到MiSeq 盒式磁带上。
运行MiSe q 。将扩增的174 bp DNA（包括Illumina衔接子和索引序列）的样品库应用于MiSeq 系统。运行条件是在双末端流通池中进行双索引测序，以读取76 bp，包括扩增的38 bp条形码序列。ř 具有代表性的结果MiSeq 运行示于图5. 该协议也适用于其他平台，例如HiSeq 在Illumina的系列。

图5. 使用Sequencing Analysis Viewer（SAV）运行MiSeq的概述。MiSeq的代表性结果用于使用条形码蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用库。SAV是一款允许查看测序运行质量指标的应用程序（详细信息请参见此处）。流动槽图表（左）显示了每行（流动槽的一部分）数据质量的颜色矩阵。MiSeq 的流通池是单通道流通池。“按周期列出的数据”（中上部）显示了信号强度，Q30得分和碱基百分率的曲线图，可以指示每个周期的序列数据质量。“数据按泳道”（底部中间）显示了通过过滤器的簇的密度，以原始簇密度的百分比表示。QScore 分布（右上方）显示使用QScore 读取的百分比。甲QScore ≥30，与一个质量得分为30或更高的碱基的百分比，是正相关于基座的通话质量。QScore 越高表示发生错误的可能性越小。质量分数的30表示1在1错误率，000，以99.9％的相应的呼叫的精度。有关QScore 的详细说明，请参见此处。

菜谱
用于试剂和溶液
HaloTag 融合蛋白的质粒模板DNA
ORF进入克隆可从拟南芥生物资源中心（ABRC，可在此处获得）获得，每个pENTR 克隆价格为13 美元。
Plusgrow II
每升蒸馏水添加40克Plusgrow II
高压灭菌15分钟
50 °C 高压灭菌后，加入1 ml 1 00 mg / ml 氨苄西林
氨苄西林
加入1 ，000毫克氨苄青霉素每10毫升蒸馏水钠盐（100毫克/毫升）
Azido- HaloTag 配体AzHLT-1
制备500 μM 的配体，在10mM的最终浓度DMSO
可根据要求从日本东京医科和牙科大学的Takamitsu Hosoya 博士获得配体（thosoya.cb@tmd.ac.jp）
使用转录和翻译（TNT）T7耦合的小麦胚芽提取系统将IVX混合物用于一个反应
50 微升小麦胚芽（使用前解冻-80℃）
4 微升TNT缓冲
6 微升减去蛋氨酸的氨基酸混合物
6 微升减去亮氨酸/ 半胱氨酸的氨基酸混合物
2 微升RNase抑制剂
2 微升T7聚合酶
2 微克HaloTag 质粒模板DNA
用DEPC水使体积达到100μl
缓冲液A2
制备1 NaHPO的M个4 （钠氢磷酸酯），1M的NaH 2 PO 4 （磷酸二氢钠，5M的NaCl（钠chrolide ），和2M的咪唑
混合的1.935毫升的Na的1M 2 HPO 4 ，0.565毫升的的NaH的1M 2 PO 4 ，5毫升5M的NaCl，和0.75毫升2M的咪唑
加入dH 2 O，使混合物的总体积为50 ml（将添加约41.75 ml的dH 2 O）。
缓冲区B2
混合的钠的1M1.935毫升2 HPO 4 ，0.565毫升的的NaH的1M 2 PO 4 ，5毫升5M的NaCl，和12.5毫升2M的咪唑
加入dH 2 O使混合物的总体积为50 ml（将添加约30 ml的dH 2 O）
1 M咪唑
将3.4克咪唑溶于蒸馏水至50毫升
存放在RT
PBS缓冲液
将1 片pH 7.4的PBS片剂（Takara）在蒸馏水中溶解至1,000毫升
存放在RT
PBST
用0.1％（w / v）Tween-20将1 片pH 7.4 的PBS片剂（Takara）溶于1000毫升蒸馏水中
存放在RT
稀释缓冲液
10毫升无RNase的水和10 微升的10％吐温20
HaloTag TMR配体
稀1：100在DMSO（即，用于染色HaloTagged 蛋白，加入1 微升TMR配体由DMSO稀释至5-10后微升的HalTa 克来自步骤20融合蛋白）
50％聚乙二醇
每20毫升蒸馏水添加10克PEG8000
高压灭菌15分钟
500 µ M 环炔修饰的100 bp DNA寡核苷酸
条形码DNA 列在表1中。这些是由Eurofins合成的，是经二苯并环辛炔（DBCO）和3'-修饰的四甲基罗丹明（TMR）5'-修饰的单链DNA 。添加不含RNA酶的水中，以制备500 μ M. 储存于-20 ℃。
用于文库制备的正向和反向索引引物
Ť 他引物序列的表2中列出并作为合成再通过欧陆单链DNA

Acknowledg 发言：
该协议已从Yazaki 等人衍生并改编。（2020）。我感谢小林淳夫和川岛佑介的技术帮助。这项工作得到了住友基金会基础科学研究项目的资助[JY 140384]和武田科学基金会，JY的有远见的研究资助。这项工作还得到了教育，科学，体育和文化部的部分资助。 -科学研究资助（C），2019-20 21 [ JK0574 to JY]。我还要感谢Editage （www.editage.jp）进行英语编辑。

利益争夺
作者宣称没有利益冲突。

参考文献
Gu，L.，Li，C.，Aach ，J.，Hill，DE，Vidal，M.和Church，GM（2014）。DNA条形码蛋白的多重单分子相互作用分析。自然515（7528）：554-557。
Setliff ，I.，Shiakolas ，AR，Pilewski ，KA，Murji ，AA，Mapengo ，RE，Janowska ，K.，Richardson，S.，Oosthuysen ，C.，Raju，N.，Ronsard，L.，Kanekiyo ，M. ，Qin，JS，Kramer，KJ，Greenplate ，AR，McDonnell，WJ，Graham，BS，Connors，M.，Lingwood ，D.，Acharya，P.，Morris，L。和Georgiev ，IS（2019）。B细胞受体序列与抗原特异性的高通量映射。细胞179（7）：1636-1646 e1615。
Shahi，P.，Kim，SC，Haliburton，JR，Gartner，ZJ和Abate，AR（2017）。Abseq：超高通量单细胞蛋白质谱分析，具有微滴微滴条形码技术。科学代表7：44447。
Stoeckius ，M.，Hafemeister ，C.，Stephenson，W.，Houck-Loomis，B.，Chattopadhyay，PK，Swerdlow ，H.，Satija ，R.和Smibert，P.（2017）。在单个细胞中同时进行表位和转录组测量。Nat Methods 14（9）：865-868。
汤普森A.，谢弗J.，库恩K.，肯尼勒S.，施瓦茨J.施密特G.，诺伊曼T.约翰斯通R.穆罕默德AK哈蒙C. （2003年）。串联质量标签：通过MS / MS对复杂蛋白质混合物进行比较分析的新型定量策略。甲nalytical化学75 （18）：4942-4942 。
Yazaki，J.，Galli，M.，Kim，AY，Nito ，K.，Aleman，F.，Chang，KN，Carvunis ，AR，Quan，R.，Nguyen，H.，Song，L.，Alvarez，JM ，Huang，SS，Chen，H.，Ramachandran，N.，Altmann，S.，Gutierrez，RA，Hill，DE，Schroeder，JI，Chory ，J.，LaBaer ，J.，Vidal，M.，Braun，P 。and Ecker，JR（2016）。使用HaloTag蛋白阵列定位转录因子相互作用组网络。PROC国家科科学院科学USA 113（29）：E4238-4247。
Yazaki，J.，Galli，M.，Kim，AY和Ecker，JR（2018）。使用HaloTag-NAPPA 原位蛋白阵列分析相互作用组网络。Curr Protoc Plant Biol 3（3）：e20071。
矢崎，J.，川岛，Y.，小川，T.，小林，A.，大越，M.，渡边，T.，吉田，S.，纪伊国，I.，江头，S.，雨贝，M.，Hosoya ，T.，Shiroguchi ，K.和Ohara，O.（2020）。基于HaloTag的蛋白质与条形码寡核苷酸的结合。Nucleic Acids Res 48（2）：e8。