材料和试剂

1. 15厘米培养皿（组织培养皿）（康宁，猎鹰，目录号：08-772-6）

2. 转移移液管（Fisherbrand，目录号：13-711-7M）

3. 注射器3ml（BD，目录号：309657）

4. 10毫升注射器（BD，目录号：302995）

5. 不锈钢304注射器针头（Sigma，目录号：Z117021-1EA）

6. PrecisionGlide针22G（BD，目录号：305159）

7. Immbilion-P PVDF膜（微孔西格玛，目录号：IPVH10010）

8. 50毫升锥形管

9. 开顶薄壁超透明管（38.5 ml），25 x 89 mm（Beckman Coulter，产品编号：344058）

注：文本“38.5 ml超透明管”。

10. 开顶薄壁超透明管（13.2 ml），14 x 89 mm（Beckman Coulter，目录号：344059）

注：文本“13.2ml超透明管”。

11. 4-20%Criteron Tris HCl蛋白凝胶，26孔（Bio-Rad，目录号：3450034）

12. OptiPrep（西格玛，目录号：D1556-250ml）

13. 蔗糖（费希尔化学，目录号：S5-3）

14. HEPES（西格玛，目录号：H4034-1Kg）

15. 氯化钠（费希尔化学，目录号：S271-3）

16. 胎牛血清（FBS）（VWR，目录号：89510-194）

17. FBS exo耗尽（系统生物科学，目录号：exo-FBS-250A-1）

18. RPMI+谷氨酰胺（Gibco，目录号：10566-016）

19. 牛血清白蛋白（BSA）（西格玛，目录号：A3294-100G）

20. 抗体

CD9（细胞信号技术，目录号：13174S）

MFG-E8（研发系统，目录号：MAB2767）

ITGA3（Abcam，目录号：ab190731）

CD63（费希尔科学，目录号：BDB556019）

Dicer（圣克鲁斯，目录号：sc30226）

Flot-2（BD Biosciences，目录号：610383）

IgG抗兔HRP连锁（Sigma Millipore，目录号：GEN934-1ml）

IgG抗兔HRP连锁（Sigma Millipore，目录号：NXA931-1ml）

21. 二硫苏糖醇（DTT）（Goldbio，目录号：DTT25）

22. 十二烷基硫酸钠（SDS）（J.T.Baker，目录号：4095-02）

23. 吐温-20（西格玛，目录号：P7949-500ml）

24. Tris缓冲盐水（TBS，pH 7.6）

25. 溴酚蓝（Bio-Rad，目录号：161-0404）

26. 甘油（AMRESCO，目录号：M152-4L）

27. 甘氨酸

28. 甲醇（费希尔化学，目录号：A452-4）

29. 哺乳动物细胞培养基（见配方）

细胞培养生长培养基

胞外体缺失培养基

30. 储备溶液（见配方）

1米HEPES pH值7.4

浓缩OptiPrep缓冲液

1米DTT

1米Tris pH 6.8

4x Laemmli缓冲器

4x Laemmli缓冲器，无DTT

10倍传输缓冲器

OptiPrep工作液

31. 缓冲溶液（见配方）

电动汽车缓冲器

蔗糖缓冲垫

浓缩蔗糖垫

OptiPrep工作液25%、20%、15%、10%、5%

TBS-T公司

设备

1. 折射计（费希尔科学公司）

2. Sorvall RC 6+离心机（Thermo-Scientific，型号：46910）

3. 固定角转子F14S-6X250y FiberLite（Thermo Scientific，目录号：78500）

4. 超离心机（Beckman Coulter，型号：Optima XE-90，目录号：A94471）

5. 摆动式铲斗转子SW 32 Ti和铲斗组（Beckman Coulter，目录号：369694）

6. 摆动式铲斗转子SW 41 Ti和铲斗组（Beckman Coulter，目录号：311362）

7. ChemiDoc MP成像系统（Bio-Rad Laboratories，型号：ChemiDoc MP 10）

软件

1. ImageLab软件4.0版

2. 图像J

3. GraphPad棱镜

程序

A、细胞培养

1. 将MDA-MB-231细胞在4个15 cm的培养皿中在30 ml细胞培养生长培养基中生长（见配方A1），直到细胞达到80%融合（此时的细胞数为每个培养皿约16 x 106个细胞）。

笔记：

a。可使用其他哺乳动物细胞模型。这种方法已经成功地分离了几种哺乳动物细胞的sEV亚群：HEK-293T、MCF7、MCF10A、MDA-MB-231、PC12和N2A细胞。

b。这些培养皿中可供细胞生长的表面面积为151.9平方厘米。用于这些培养皿的细胞培养生长培养基的总体积为30ml。

2. 将四个15厘米的培养皿扩大到总共14个15厘米的培养皿，每个培养皿在播种时含有大约4×106个细胞，培养基中含有30毫升的胞外体（见配方A2）。

注：以下步骤可处理的介质最大体积为420毫升。

3. 培养3天或直到细胞达到80%融合。继续中收集。

注意：不要让细胞过度流动，我们已经观察到在过度对流培养中SEV的急剧下降。

B、条件培养基收集和细胞外小泡沉积

1. 从14个15厘米的盘子中收集条件培养基，倒入足够的容器中。收集的条件培养基总量约为420 ml。

2. 在Sorvall RC 6+离心机（带固定角度转子F14S-6X250y纤维筛（或等效物））中，在4°C下离心处理条件培养基15分钟，使其进入沉淀浮池（低速旋转）。

3. 离心机停止后，立即将上清液轻轻倒入新容器中。小心不要打乱弹丸。

4. 在带有固定角度转子F14S-6X250y纤维筛的Sorvall RC 6+离心机中，以10000 x g的速度离心上清液15分钟，以沉淀细胞碎片和大型细胞外囊泡（中速旋转）。

5. 离心机停止后，立即将上清液轻轻倒入新容器中。小心不要打乱弹丸。

6. 将32毫升收集的上清液加入一个38.5毫升的超透明试管中。重复此步骤5次，总共填充6个38.5 ml超透明试管。

注意：此步骤将消耗~200 ml的条件培养基。将剩余的~220保存在4°C下进行第二轮超速离心（步骤B11）。

7. 将304不锈钢针头连接到10毫升注射器上。用蔗糖垫填充10毫升注射器（见配方C2）。

8. 快速将不锈钢针插入装有38.5 ml超透明管的调节介质中，直到到达试管底部。加入2ml蔗糖垫，立即取出不锈钢针。对总共6个38.5 ml超透明试管重复此步骤5次。

9. 在最大加速度和制动条件下，使用SW32 Ti转子在4°C下以约100000 x g（29500 RPM）离心1.5 h。

10. 紧接着，用固定在真空系统上的吸液管将上清液从顶部吸到蔗糖缓冲垫的正上方。小心不要吸入座垫和调节介质的界面（这是SEV沉淀的地方）。吸气，直到将约4-5毫升的条件培养基放在蔗糖垫上。重复此步骤5次，总共6个38.5 ml超透明试管。

11. 非常小心地将剩余的条件培养基（步骤B6）添加到每个38.5 ml超透明试管中。通过使用转移移液管（见材料）并沿着管壁缓慢、平稳地添加调节介质。必须避免蔗糖缓冲液的干扰。任何快速浇注都会扰乱蔗糖缓冲。

12. 重复步骤B9和B10。

13. 用1毫升微量移液管小心收集并丢弃吸入后残留在蔗糖垫上的~4-5毫升~2-3毫升。这样做，直到有~2毫升的条件培养基留在蔗糖垫上。

注：在这一步中，建议使用1ml微量吸液管，而不是真空抽吸。在这一步中使用1毫升微量移液管，可以更有效地控制/准确地收集培养基。

14. 收集剩余的2毫升条件培养基，加上最上面的1毫升蔗糖缓冲液，并将3毫升保存在50毫升的锥形管中。用剩下的5根试管重复此步骤5次，并将它们集中在一个50毫升的锥形管中（最终体积约为18毫升）。

15. 使用折光计测量步骤B14中溶液的蔗糖浓度。确保浓度不超过21%蔗糖（w/v）。如果蔗糖浓度超过21%，用EV缓冲液稀释。一般来说，适当的蔗糖浓度在15%到20%之间。

注：如果B15中的蔗糖浓度超过21%蔗糖（w/v），则在步骤B18中，sEVs不会沉淀，而是在整个13.2ml超透明管中达到平衡。

16. 用步骤B15中收集的SEV填充两个13.2 ml超透明管。每根试管加入~9-11毫升。

17. 如步骤B8所示，在每个13.2 ml超透明管的底部添加1 ml蔗糖垫。

18. 在最大加速度和制动条件下，使用SW41 Ti转子在4°C下以约130000 x g（32500 RPM）离心15 h。

19. 之后，立即使用真空系统从上到下抽吸上清液。小心不要吸入缓冲垫和调节介质之间的层（这是SEV沉淀的地方）。吸气，直到将约2毫升的条件培养基放在蔗糖垫上。用剩下的13.2毫升超透明试管重复此步骤1次。

20. 用1毫升微量移液管收集并丢弃剩余在顶部的1.2毫升条件培养基。用剩下的13.2毫升超透明试管重复此步骤1次。

注：对于最后一步，建议使用1毫升微量移液管，而不是真空抽吸，以便更有效地控制/准确地收集培养基。

21. 收集13.2 ml超透明管的剩余内容物。这包括800μl条件培养基，剩余在蔗糖缓冲垫上，加上1 ml蔗糖缓冲液。将两个13.2 ml超透明管中的内容物汇集到50 ml锥形管中（此步骤中的总体积约为3.6 ml）。

22. 加入1.9毫升浓缩蔗糖缓冲液（见配方C2）并适当混合。

23. 用折光计测量蔗糖浓度。此步骤后的蔗糖浓度一般高于42%蔗糖（w/v）。值等于或大于42%是足够的。

注：如果蔗糖浓度不超过42%，则添加更多的浓缩蔗糖缓冲液，直到其等于或超过该值。如果浓度较低，来自步骤C3的OptiPrep层将具有更高的密度和下沉，阻碍适当的线性梯度的形成。

24. 从B23（500μl）中节省10%用于程序D和E中的“100000 x g颗粒”。

C、细胞外囊泡浮选成OptiPrep线性梯度和分数收集

1. 使用1 ml微量移液管，将步骤B23中剩余的5 ml添加到13.2 ml超透明管的底部。

2. 将22G针头连接到3ml注射器上。然后用25%的OptiPrep溶液填充3 ml注射器（见配方C4）。

3. 将22G针头伸入13.2ml超透明试管的最顶层。一旦22G针头距离顶层几毫米以内，非常缓慢小心地添加1.5毫升OptiPrep溶液25%。

注意：此步骤和步骤C4需要格外小心。添加OptiPrep层必须非常缓慢和顺利地完成。否则，会导致各层混合，进而导致梯度形成失败。

4. 用OptiPrep溶液20%、15%、10%和5%（见配方C4）按相应顺序重复步骤C3。

5. 使用SW41 Ti转子在4°C下以最小加速度和无制动，以约160000 x g（36000 RPM）的转速离心15小时。

注意：减速时不要刹车很重要。踩刹车会破坏sEV亚群的梯度和混合。

6. 停止后，使用1ml微量移液管从上到下收集400μl组分。图1显示了总结步骤B1到C6的示意图。

注：在黑色背景和适当的照明下可以观察到两个不同的sEV亚群（应用人工或自然光源可以帮助可视化）。两个不同的sEV亚群将显示为2个独立的白色带，与黑色背景形成对比。

图1。两步纯化方法示意图。差速超速离心后，在线性OptiPrep梯度中进行浮力密度浮选。图片取自Temoche Diaz等人。（2019年）。

7. 使用涡流器混合每个400μl组分，并测量其折射率，以确认线性。为了成功分离密度略有差异的SEV，需要形成OptiPrep线性梯度。线性的破坏会导致sEV分馏失败。

笔记：

a。线性通常在分数1到25之间观察到。剩下的6个底部部分的密度随着分数的增加几乎没有变化。

b。低密度sEV组分一般在9-11之间。高密度sEV馏分通常浮至15-17级。然而，在不同的线性梯度和sEVs平衡处的分数可能略有变化。因此，建议记录每个部分的折射率，并将该折射率与sEV的存在相匹配（通过免疫印迹，下面的步骤E）。一旦用这种方法经验地确定了与sEV亚群相对应的密度，在将来的实验中只需要测量折射率来识别含有sEV的组分。

8. 现在可将部分与4倍Laemmli缓冲液混合（参见配方B5）或按照步骤D进行浓缩。

注：某些sEV标记的检测可以成功完成，而不需要通过额外的超速离心浓缩，但是建议浓缩检测大多数sEV标记。在我们的经验中，显示出足够的灵敏度来检测标记蛋白的抗体是抗CD9、抗ITGA3和抗dicer。

D、馏分浓度

1. 将各部分与10 ml EV缓冲液混合。

2. 在最大加速度和减速度下，使用SW41 Ti转子在4°C下以~130000 x g（32500 RPM）离心1.5 h。

3. 倒出上清液。

4. 添加50-100μl 1x Laemmli缓冲液。上下吸管3-7次。室温下孵育10分钟。

注：如果需要检测CD63，则在不带DTT的1x Laemmli缓冲器中按上述规定重新投入。加入还原试剂导致抗体检测CD63失败BDB556019。

5. 收集材料并在-20°C下冷冻或立即使用。

E、免疫印迹

1. 在95°C下培养样品5分钟。

2. 在4-20%Criteron 26井凝胶中，每个通道装载10ul样品。

注：建议将样品1-3、4、5、23-25、26-28和29、30混合，以便将所有组分放入同一凝胶中。在我们的观察中，上述部分通常不包含sev（尽管我们不能排除其他细胞系中的变异）。

3. 在150 V恒压下运行1.5小时。

4. 转移到恒定电流为0.4A的PVDF膜中，持续2.5h。

5. 在TBS-T中用5%BSA封闭膜1小时（见配方C5）。

6. 在冷藏室（4°C）中用所需的一级抗体培养膜过夜。抗CD9的工作稀释度为1:3000。所有其他抗体1:1000。

7. 用TBS-T（见配方C5）清洗3次，每次清洗8分钟。

8. 用辣根过氧化物酶（HRP）结合的二级抗体（抗鼠或抗兔）在室温下孵育1h。工作稀释1:10000。

9. 用TBS-T（见配方C5）清洗3次，每次清洗8分钟。

10. 按照制造商规范添加HRP基板。使用Chemidoc成像系统进行开发。

注：我们经常使用皮尔斯ECL和western-blotting底物（Thermo-Scientific），尽管类似的化学发光基质可能会被替代。

数据分析

1. 使用ImageLab软件v4.0导出.tif图像。

2. 在ImageJ中打开图像，使用一个矩形工具突出显示条带，并通过选择Analyze a GelsáLabel peaks来量化带的强度。

注：有关如何通过ImageJ分析免疫印迹带的详细说明，请访问以下链接：https://www.sybil-fp7.eu/node/95.

3. 使用GraphPad Prism或首选程序绘制sEV标记分布图（图2B）。

4. 使用Adobe Illustrator或首选程序对撞堆栈并对齐图像（图2A）。

图2。MDA-MB-231释放出两个生化上不同的sEV亚群。A、具有代表性的sEV标志物免疫印迹图像。B、在梯度上量化每个sEV标记的强度。黑线描绘了梯度上的最大信号，显示了三个不同的区域。第一峰、第二峰和第三峰分别代表低密度EVs、高密度EVs和非囊泡蛋白RNA复合物。为了遵循国际细胞外囊泡协会（ISEV）指南（Thery等人，2018年），电子显微镜图像和纳米颗粒分析也显示在C、D和E.C.代表性电子显微照片的高密度和低密度EV样品。D、纳米颗粒追踪分析显示了高密度和低密度亚群的大小分布。图中还显示了高速颗粒。E、使用纳米颗粒跟踪分析对每个sEV亚群的粒子数进行量化。绘制的数据来自两个独立的实验；误差条表示独立样本的标准偏差。图片取自Temoche Diaz等人。（2019年）

笔记

该协议假设用户了解如何进行免疫印迹和分析数据。

食谱

A、哺乳动物细胞培养基

1. 细胞培养生长培养基

在DMEM谷氨酰胺中添加10%的FBS

2. 胞外体缺失培养基

在DMEM谷氨酰胺中添加10%的外消旋FBS

B、储备溶液

1. 1 M HEPES pH值7.4（500毫升）

a、将119.2 g HEPES溶于400 ml ddH2O中

b、加入10 N NaOH，直到pH值达到7.4

c、添加ddH2O至500 ml

d、储存于4°C

2. 浓缩OptiPrep缓冲液（100毫升）

a、将0.85 g氯化钠溶解于70 ml ddH2O中

b、添加6 ml pH值为7.4的1 M HEPES

c、添加ddH2O至100毫升

3. 1米DTT（10毫升）

a、将1.5 g DTT溶于6 ml ddH2O中

b、添加ddH2O至10mL

c、制备1ml等分试样

d、储存于-20°C

4. 1 M Tris pH 6.8（100毫升）

a、在80 ml ddH2O中溶解12.1 g Tris碱

b、用10 N HCl将pH调至6.8

c、添加ddH2O至100毫升

5. 4x Laemmli缓冲液（20 ml）

a、将1.6克十二烷基硫酸钠溶解于6毫升ddH2O中

b、添加5 ml pH值为6.8的1 M Tris HCl

c、添加1.23 g DTT。溶解

d、 8毫克溴酚蓝

e、加入8毫升甘油

f、添加ddH2O至20毫升

g、制备1ml等分试样

h、储存于-20°C

6. 4x Laemmli缓冲液，无DTT（20毫升）

按照配方B5操作，但不包括DTT。

7. 10x传输缓冲器（1L）

a、将114.2 g甘氨酸溶于400 ml ddH2O中

b、添加24.2 g Tris碱。溶解

c、向1L中添加ddH2O

d、储存于4°C

8. OptiPrep工作液

a、将10毫升OptiPrep与2毫升浓缩OptiPrep缓冲液混合

b、储存于4°C

C、缓冲区/解决方案

1. EV缓冲液（100毫升）

a、将0.85 g氯化钠溶解于70 ml ddH2O中

b、添加1 ml pH值为7.4的1 M HEPES

c、添加ddH2O至100毫升

d、储存于4°C

2. 蔗糖垫（40毫升）

a、在50 ml锥形管中加入27 g蔗糖

b、添加EV缓冲液至40 ml。溶解蔗糖

注：持续搅拌约10分钟，使蔗糖完全溶解。

c、测量折射率并计算蔗糖浓度

d、通过添加更多的蔗糖或用EV缓冲液稀释，调整到60%（w/v）的蔗糖

注：在40 ml溶液中加入24 g蔗糖，不会产生60%的蔗糖溶液（通过折射率测量）。因此，建议用27g蔗糖开始步骤2a。

e、储存于4°C

3. 浓缩蔗糖垫（40毫升）

a、在50毫升锥形管中加入31克蔗糖

b、加入EV缓冲液至40 ml。完全溶解蔗糖

c、取折射率，计算蔗糖浓度

注：该溶液的蔗糖浓度约为65%。

d、储存于4°C

4. OptiPrep工作液（5毫升）

按照下表1制备OptiPrep工作液。

表1。OptiPrep工作介质不同浓度计算表

OptiPrep工作液（ml）

EV缓冲液（ml）

OptiPrep 25%

2.5

2.5

OptiPrep 20%

2

3

OptiPrep 15%

1.5

3.5

OptiPrep 10%

1

4

OptiPrep 5%

0.5

4.5

5. TBS-T公司

0.1%吐温20（v/v），1x TBS

致谢

我们要感谢现任和前任Schekman实验室的成员，他们在本协议的开发过程中提供了技术建议。我们也感谢霍华德休斯医学院的资助。本方案改编自Temoche Diaz等人，2019年。

相互竞争的利益

作者声明没有利益冲突。

工具书类

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