材料和试剂

1. 玻璃盖玻片（Fisher Scientific，目录号：12-545-100）

2. 40 μm电池过滤器（Fisher，目录号：22-363-547）

3. 成年C57Bl/6小鼠

4. L929细胞[或100 U/ml重组M-CSF（Prospec，目录号：CYT-439）]

5. GL261小鼠胶质瘤细胞

6. 2.5%避免

7. 汉克生理盐水缓冲液（HBSS）

8. 荧光乳胶珠（羧酸改性聚苯乙烯，荧光红；0.5-μm平均粒径，西格玛，目录号：L3280）

9. 荧光共轭Alexafluor488山羊抗兔（Life Technologies，目录号：A-11008）

10. 汉克生理盐水缓冲液（HBSS）（康宁，目录号：MT-20-023-CV）

11. DMEM（康宁，目录号：10-017-CM）

12. FBS（VWR，目录号：10221-866）

13. 抗生素抗真菌（Fisher，目录号：10-221-866）

14. 丙酮酸钠（VWR，目录号：13-115E）

15. PFA（4%多聚甲醛）（Acros，目录号：AC169650010）

16. Triton X-100（西格玛，目录号：X100）

17. 正常山羊血清（Southern Biotech，目录号：0060-01）

18. BSA（VWR，目录号：RLBSA50）

19. 达皮福蒙特（南方生物科技，目录号：0100-20）

20. Iba1抗体（美国Wako公司，目录号：19-19741）

21. 编号L65LPS（L65LPS）

22. 小鼠干扰素γ（罗氏，目录号：11276905001）

设备

1. 徕卡SP8X共焦成像系统

珠子（λex~575 nm；λem~610 nm）

亚历山大488（λex 490 nm；λem~525 nm）

2. -80°C冷冻机

软件

1. 斐济（Schindelin等人，2012年）

程序

A、细胞培养

注：除非另有说明，否则细胞生长在在5%二氧化碳和37°C条件下，10%FBS和1%抗生素抗真菌。

1. 使用生长至80-90%融合率和血清饥饿24小时的GL261小鼠胶质瘤细胞生成胶质瘤条件培养基（GCM）。收集培养基并将其储存在-80°C直到使用。

2. 从生长到90-100%融合的L929细胞中收集L细胞培养基，并维持10天。这些培养基富含集落刺激因子1（CSF1），一种用于驱动单核细胞增殖和分化为巨噬细胞的因子。

3. 如前所述，从成年C57Bl/6小鼠中培养单核细胞（Zhang et al.，2008）：简言之，用2.5%的阿维汀对动物进行深度麻醉，并通过颈椎脱位进行安乐死。解剖股骨和胫骨，用Hank's缓冲盐水（HBSS）中的1%血清冲洗骨腔。收集的骨髓通过40-μm细胞过滤器过滤，并在含有DMEM、10%FBS、1%抗生素抗真菌、1%丙酮酸钠和20%L细胞培养基（或100 U/ml重组m-CSF）的完整培养基中进行培养。

4. 细胞保持在5%CO2和37°C。培养7-9天后，巨噬细胞分化。

B、吞噬试验

实验1：将巨噬细胞镀在玻璃盖玻片上，用上述完整培养基或完全培养基加50%GCM培养24小时。

实验2：如上所述，用生理盐水（对照）或100 ng/ml LPS（西格玛）和100 U/ml干扰素γ（罗氏）培养24小时。

1. 将荧光乳胶珠（羧基改性聚苯乙烯，荧光红；0.5-μm平均粒径，Sigma，L3280）添加到0.1μg/ml的最终浓度，并培养2 h。用HBSS冲洗去除多余的颗粒后，在室温下将细胞固定在4%PFA中20分钟。

2. 固定细胞用PBS冲洗，并在0.1%tritonx-100和5%正常山羊血清中阻断1h。将它们与抗Iba1（1:500，Wako）在0.01%Triton X-100和30 mg/ml BSA中在4°C下孵育过夜。

3. 然后用PBS冲洗细胞，并与荧光共轭alexfluro488山羊抗兔孵育1h。

4. 用PBS再次冲洗细胞，并使用DAPI Fluormount（Southern Biotech）覆盖。

C、共焦成像

图像采集在徕卡SP8X共焦成像系统上。10µm z-stacks以40倍的分辨率拍摄，分辨率为512 x 512像素。使用斐济处理共焦图像（Schindelin等人，2012年）。在这个过程中，五个区域被成像，并且每次治疗至少有100个细胞被量化。为了评估吞噬功能，计算细胞总数和有内化珠的细胞数量。通过计算每个细胞的珠子数，测量细胞面积和荧光珠通道投影像素的积分密度，进一步分析图像。在下游分析之前，对异常值进行综合密度值分析。分步图像分析协议在补充文件1中提供。

数据分析

数据分析在R for Windows中执行。可以通过GitHub访问方法和交互式UI，以便用户上载和分析数据（RShinyApp；GitHub Repo）。

结果

一种高吞吐量的数据采集方法

在第一个实验中，我们量化了巨噬细胞对GCM的吞噬反应。肿瘤相关巨噬细胞被认为是高度激活和促肿瘤的。它们的吞噬活性可能通过促进伤口愈合和抗炎表型的机制与肿瘤支持行为有关。共焦成像允许完全3D捕获吞噬荧光珠的巨噬细胞（图1A）。标准方法试图计算每个细胞吞噬的珠子数量。然而，一些细胞表现出低水平的吞噬活性，而另一些细胞则受到刺激并摄取更多的珠子。这种非标准化的吞噬活性对于量化和分析来说是有问题的。珠子在z-stack层内和跨层重叠，使得区分和计数单个珠子变得困难。此外，计算单个视野中每个细胞的珠子数量可能需要15分钟以上，这使得大量技术复制的数据采集非常耗时。这突出了与这种量化方法相关的技术挑战。

为了解决这一问题，其他人已经量化了珠信号阳性或阴性的细胞数量，从而产生了一个对治疗有吞噬作用的细胞比率（Lian等人，2016年；Roy等人，2018年）。虽然时间效率更高，但这种方法不能捕捉到发生的相对吞噬量的变化，即每个细胞的吞噬活性。如图1a所示，细胞吞噬不同数量的珠子。也使用了其他方法来获取吞噬功能，如荧光激活细胞分选（FACS）（Pul等人，2013年），但它们需要更多的准备时间、实验对照（阴性荧光对照、补偿技术等），以及一些昂贵的试剂和结合抗体。

我们开发了一种利用乳胶珠产生的离散荧光信号的技术管道。通过对珠子通道的z堆栈上的荧光像素求和，我们创建了一个单一的度量。通过使用感兴趣区域（ROI）功能，我们可以为视野内的每个单元格捕获此度量。这种数据收集方法允许在2分钟内分析一个区域内的所有细胞，比计算单个珠子/细胞的速度要快得多。它允许在一个实验中分析数百个细胞。

为了验证这种荧光指标，我们将这种方法产生的信号与之前进行的每个细胞的珠子计数进行了比较（图1B）。采用简单线性回归分析。模型具有较高的显著性（P<0.001），斜率系数为0.53，调整后的r2=0.363。这种关系也被斯皮尔曼的rho值0.683所证实。因此，通过对整个z-stack中的像素求和来生成荧光信号是一种精确而敏感的测量，它反映了每个细胞所吞噬的珠子的数量。它为现有的量化方法提供了一种高通量的替代方案。

图1。共焦成像和荧光乳胶微球孵育后巨噬细胞的分析。 A、在两种治疗条件下，可以看到被Iba1染色（绿色）的巨噬细胞吞噬荧光乳胶珠（红色）。正交视图也显示，显示细胞完全吸收珠子。注意细胞间珠信号的变化。DAPI标记细胞核。B、散点图，比较从珠子获得的荧光信号与每个细胞计数的实际珠子数。y=-22.40619+0.52782x。P<2.2e-16。调整后的r2=0.3634。斯皮尔曼系数=0.683。C、假设数据集的直方图和密度图。对于dist1和dist2两个群体，n=100，平均值=50，中值=50。D、 A组实验数据的直方图和密度图，实验1。完整的描述性统计见表S1。

利用经验累积分布函数作为吞噬活性的度量

用这种方法呈现的数据在实验组内的所有细胞中产生了荧光信号的连续分布（图1D）。标准统计方法将使用参数或非参数统计检验分别比较每个分布的平均值或中间值。然而，让我们考虑两个假设分布，其中概率分布函数（PDF）是非同余的，但它们之间的平均值和中值是相等的（图1C，表S1）。参数检验和非参数检验都拒绝了替代假设，并推断出两个分布之间没有差异，但很明显，两个样本之间的事件分布有很大的不同。这表明，对于非参数、多模态分布，标准t检验或Mann-Whitney U检验是不够的，并且在一定条件下会失效。从生物学角度解释，这些测试可能缺乏检测巨噬细胞受到挑战时吞噬细胞内流的“变化”的能力，例如用GCM治疗。

如果我们考虑这些分布的经验累积分布函数（ECDF），它更恰当地表示了随着PDF扩展而存在的变化（图2A）。为了比较这些分布，我们应用了来自最佳质量传输领域的原理，也就是地球运动理论。这些方法根据它们的底层ecdf来比较数据。为了计算从我们的假设数据和实验数据得出的ECDF之间的差异，我们接下来进行了Kolmogorov-Smirnov检验（KS检验），其中D统计量由：

其中F1，n和F2，m是两个一维数据集的ECDF，以及是上界函数，计算ECDF之间的绝对最大距离（图2A）。在给定显著性水平α，Dn，m>Dn，m，α，其中Dn，m，α是临界值，其中Dn，m，α是由以下公式得出的临界值：

假设分布E-2=771.5和假设分布。这清楚地表明，与标准t检验或Mann-Whitney U检验相比，用这种方法处理多峰分布具有优势。当应用于我们的实验数据时，KS的结果为D=0.24和P=2.2e-4（图2B），这表明巨噬细胞增加吞噬活性的概率更准确地反映在所收集的数据中，通过分析ECDF获得的PDF中。这些结果还表明，暴露于GCM可显著提高巨噬细胞的吞噬活性。

KS试验与报告方法的比较

为了进一步评估KS试验的敏感性，我们进行了第二个实验，将巨噬细胞暴露于典型的促炎/M1激活剂LPS和IFNγ。我们通过将吞噬小球阳性细胞数除以视野内细胞总数来计算吞噬细胞百分比（Lian et al.，2016；Roy et al.，2018）。结果表明，暴露于LPS和IFNγ的细胞的吞噬能力有增加的趋势，但是，高变异性和缺乏技术复制品未能拒绝标准双样本参数和非参数试验的无效假设（图2C）。然后，我们使用KS检验生成两个治疗组的PDF和ECDF（图2D）。这导致D=0.15和P=0.04，因此检测到吞噬活性的微小但显著的变化，这可以从直方图、密度曲线和ECDF的右移看出。虽然与GCM治疗后观察到的结果相比没有那么大的增加，但这一结果与已发表的文献（Wu et al.，2009；Scheraga et al.，2016；Caponegro et al.，2019）一致，并验证了该方法，突出了其高通量和敏感性。

图2。使用传统指标和新的分析方法对吞噬功能的量化进行比较。 A、非参数、多模态假设数据集dist1和dist2的经验累积分布函数（ECDF）。ECDF更准确地描述了底层PDF中发生的变化。B、从图1A实验1获得的实验数据的ECDF。绘制D统计量，显示曲线之间的最大距离。C、用传统的量度法来量化体外的吞噬作用，用每个视野中的细胞总数来划分被吞噬珠呈阳性的细胞。数据来源于实验2。D、上面板：使用新方法对实验2得到的数据进行直方图和密度曲线。PDF中的右移用箭头表示。底部面板：实验2数据的ECDF。绘制D统计量，显示曲线之间的最大距离。

讨论

在吞噬试验数据的收集和分析方面缺乏标准化。虽然有几种技术提供了定量的积极吞噬细胞的解决方案，但吞噬活性的增加，即吞噬细胞增加/减少的相对数量或大小，没有被研究。在这里，我们建议在将连续数据转换为ECDF之后使用KS测试。KS检验得到了最优质量输运理论的支持，该理论最终描述了两种分布，并试图计算它们之间的距离。从2018年到2019年，在各种各样的机器学习理论中，如Schouri等人，利用了机器迁移理论中的多种方法。因此，对cdf的分析深入地描述了高阶PDF和从中导出的真实世界数据。这是收集和分析单核细胞吞噬试验数据的灵敏和准确的技术管道。从数据中得到的更精细的细节反映了这些先天免疫细胞所经历的巨大变化。虽然我们表明，我们的方法捕捉到的信号与每个细胞的珠子数量直接相关，但研究人员应注意实验注意事项，例如来自未被吞噬的珠子的背景、细胞-细胞的吞噬以及轴向平面的不完全捕获。

致谢

我们要感谢齐尔卡实验室的成员和Rome Sandhu博士的有益讨论和编辑。这项工作得到了K12GM102778（KKT）、R25 CA214272（MT）和SBU种子基金（SET）的部分支持。

竞争利益：作者声明没有利益冲突或利益冲突。

工具书类

1. 卡波涅格罗医学博士，托雷斯，L.F.，拉斯特加尔，C.，拉思，N.，安德森医学博士，罗宾逊J.K.和齐尔卡，S.E.（2019年）。Pifithrin mu调节小胶质细胞活化，促进脊髓损伤后组织学恢复。中枢神经系统疾病25（2）：200-214。

2Kolori，S.，Pope，P.E.，Martin，C.E.和Rohde，G.K.（2018）切片瓦瑟斯坦自动编码器：一个令人尴尬的简单生成模型。2Kolori，S.，Pope，P.E.，Martin，C.E.和Rohde，G.K.（2018）切片瓦瑟斯坦自动编码器：一个令人尴尬的简单生成模型。arXiv电子版。

三。Lian，H.，Roy，E.和Zheng，H.（2016年）。小胶质细胞吞噬试验。三。Lian，H.，Roy，E.和Zheng，H.（2016年）。小胶质细胞吞噬试验。生物协议6（21）：e1988。

4Pul，R.，Chittapen，K.P.和Stangel，M.（2013年）。用流式细胞仪定量分析小胶质细胞吞噬功能。4Pul，R.，Chittapen，K.P.和Stangel，M.（2013年）。用流式细胞仪定量分析小胶质细胞吞噬功能。方法分子生物学1041:121-127。

5Roy，S.，Bag，A.K.，Dutta，S.，Polavaram，N.S.，Islam，R.，Schellenburg，S.，Banwait，J.，Guda，C.，Ran，S.，Hollingsworth，M.A.，Singh，R.K.，Talmadge，J.E.，Muders，M.H.，Batra，S.K.和Datta，K.（2018年）。巨噬细胞源性神经肽-2具有新的促肿瘤作用。5Roy，S.，Bag，A.K.，Dutta，S.，Polavaram，N.S.，Islam，R.，Schellenburg，S.，Banwait，J.，Guda，C.，Ran，S.，Hollingsworth，M.A.，Singh，R.K.，Talmadge，J.E.，Muders，M.H.，Batra，S.K.和Datta，K.（2018年）。巨噬细胞源性神经肽-2具有新的促肿瘤作用。癌症研究78（19）：5600-5617。

6Scheraga，R.G.，Abraham，S.，Niese，K.A.，Southern，B.D.，Grove，L.M.，Hite，R.D.，McDonald，C.，Hamilton，T.A.和Olman，M.A.（2016年）。TRPV4机械敏感离子通道调节脂多糖刺激的巨噬细胞吞噬功能。6Scheraga，R.G.，Abraham，S.，Niese，K.A.，Southern，B.D.，Grove，L.M.，Hite，R.D.，McDonald，C.，Hamilton，T.A.和Olman，M.A.（2016年）。TRPV4机械敏感离子通道调节脂多糖刺激的巨噬细胞吞噬功能。免疫学杂志196（1）：428-436。

7Schiebinger，G.，Shu，J.，Tabaka，M.，Cleary，B.，Subramanian，V.，Solomon，A.，Gould，J.，Liu，S.，Lin，S.，Berube，P.，Lee，L.，Chen，J.，Brumbaugh，J.，Rigollet，P.，Hochedlinger，K.，Jaenisch，R.，Regev，A.和Lander，E.S.（2019年）。单细胞基因表达的最佳转运分析确定了重编程的发育轨迹。7Schiebinger，G.，Shu，J.，Tabaka，M.，Cleary，B.，Subramanian，V.，Solomon，A.，Gould，J.，Liu，S.，Lin，S.，Berube，P.，Lee，L.，Chen，J.，Brumbaugh，J.，Rigollet，P.，Hochedlinger，K.，Jaenisch，R.，Regev，A.和Lander，E.S.（2019年）。单细胞基因表达的最佳转运分析确定了重编程的发育轨迹。电话176（4）：928-943 e922。

8Schindelin，J.，Arganda Carreras，I.，Frise，E.，Kaynig，V.，Longair，M.，Pietzsch，T.，Preibisch，S.，Rueden，C.，Saalfeld，S.，Schmid，B.，Tinevez，J.Y.，White，D.J.，Hartenstein，V.，Eliceri，K.，Tomancak，P.和Cardona，A.（2012年）。斐济：生物图像分析的开源平台。8Schindelin，J.，Arganda Carreras，I.，Frise，E.，Kaynig，V.，Longair，M.，Pietzsch，T.，Preibisch，S.，Rueden，C.，Saalfeld，S.，Schmid，B.，Tinevez，J.Y.，White，D.J.，Hartenstein，V.，Eliceri，K.，Tomancak，P.和Cardona，A.（2012年）。斐济：生物图像分析的开源平台。Nat方法9（7）：676-682。

9吴廷琰、陈天利、陈瑞敏（2009）。脂多糖通过toll样受体4依赖性途径触发巨噬细胞激活炎症细胞因子表达、趋化、吞噬和氧化能力：通过RNA干扰验证。9吴廷琰、陈天利、陈瑞敏（2009）。脂多糖通过toll样受体4依赖性途径触发巨噬细胞激活炎症细胞因子表达、趋化、吞噬和氧化能力：通过RNA干扰验证。毒理学Lett 191（2-3）：195-202。

10Zhang，X.，Goncalves，R.和Mosser，D.M.（2008年）。小鼠巨噬细胞的分离与鉴定。10Zhang，X.，Goncalves，R.和Mosser，D.M.（2008年）。小鼠巨噬细胞的分离与鉴定。电流原免疫第14章：第14单元11。