材料和试剂

移液器技巧：
0.1-10 微升（索伦森Bioscience公司，目录号：70600）

1-200 微升（索伦森Bioscience公司，目录号：70520）

100-1,000 微升（索伦森Bioscience公司，目录号：70540）

1.5毫升Eppendorf Safe-Lock管（Eppendorf，目录号：022363204）
22 ml培养管，硼硅酸盐玻璃（VWR，目录号：47729-580）
15 ml锥形管（Denville Scientific，目录号：C1018-P）
50 ml锥形管（Denville Scientific，目录号：C1062-P）
聚碳酸酯离心管（贝克曼库尔特公司，目录号：349622）
4.5 ml方形聚苯乙烯比色杯（布鲁克海文仪器公司，目录号：BI-SCP）
200 nm聚碳酸酯膜（Millipore，目录号：GTTP01300）
的Formvar ® 涂覆的铜网格（电子显微镜科学，目录号：FCF300-CU-SC）
滤纸（VWR，目录号：28313-068）
云母片（电子显微镜科学，目录号：71855-15）
Kimwipes （Kimberly-Clark，目录号：06-666）
毛细管和塑料盖（马尔文，目录号：DTS 1070）
鼠标（杰克逊实验室演说家，型号：FVB / NJ 001800）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Corning，目录号：21-040-CV）
甲醇（Sigma - Aldrich，目录号：34860-1L-R）
二氯甲烷（Sigma - Aldrich，目录号：650463-1L）
HEPES缓冲液pH 7.4（Sigma - Aldrich，目录号：F7876）
阴性对照siRNA（Santa Cruz，目录号：sc-37007）
阳性CD98 siRNA（Santa Cruz，货号：sc-35033）
葡萄糖（Sigma - Aldrich，目录号：49163）
Turbofect TM 试剂（Thermo Fisher Scientific ，目录号：R0531）
氯化钾（KCl ，Millipore，目录号：7447-40-7）
Quant- iT Ribogreen 试剂（Invitrogen，目录号：R11491）
醋酸铀酰（Electron Microscopy Sciences，目录号：22400-4）
DiR 染料（DiIC 18 （7））（Thermo Fisher Scientific，目录号：D12731）
的Amicon ® 超15离心过滤（MWCO 10,000）（Sigma-Aldrich公司，目录号：UFC 9100 ）
1％乙酸双氧铀溶液（见ř ecipes）
5％的葡萄糖溶液（S EE ř ecipes）
设备

移液器：0.5-10 微升，10-100 微升和100-1 ，000 微升（Fisher Scientific公司，的Eppendorf，目录号：13-684-251）
粒度分析仪（布鲁克黑文仪器公司，型号：90Plus）
Zetasizer （Malvern，型号：Nano-ZS90）
原子力显微镜仪（精工电子有限公司，型号：SPA400）
透射电子显微镜（卡尔·蔡司，型号：LEO 906E）
Milli-Q Advantage A10净水系统（Millipore-sigma，货号：C10117）
离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvalis ST16R）
超速离心机（贝克曼库尔特公司，型号：Optima L-90K）
-80℃冰箱（SO-低，型号：PV85 - 21）
Sonicator （布兰森，型号：3510）
Vortexer （科学工业，型号：200-SI0236）
旋转蒸发仪（Buchi ，型号：R-210）
真空泵（Buchi ，型号：V-700）
真空控制器（Buchi ，型号：V-800）
加热浴（步琪，型号：B-491）
蒸发瓶（Buchi ，目录号：Z402982）
脂质体挤出机（Avanti Polar Lipids，型号：小型挤出机）
酶标仪（BioTek ，型号：Synergy2）
IVIS 体内成像系统（PerkinElmer，型号：IVIS Spectrum系列）

程序

从生姜纳米颗粒（GDNP）中提取脂质
准备1.6 ml纯化的GDNPs PBS悬浮液（1 mg / ml，参见Sung 等人，2019 ）。
将22 ml玻璃培养管中的1.6 ml GDNPs悬浮液中加入6 ml甲醇/ 二氯甲烷（2：1）（v / v），彻底摇匀。
依次添加2 ml的二氯甲烷和2 ml的ddH 2 O，然后将混合物短暂涡旋。
将溶液在玻璃管中于室温（RT）下以2,000 xg离心10分钟，以分离水相和有机相（图1）。
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图1.从GDNP分离脂质的液-液萃取的代表性图像

通过移液除去上层水相。
通过移液将剩余的GDNPs提取的脂质溶液收集到新的玻璃培养管中。
用0.5 ml的1 M KCl 洗涤收集的样品，并以2,000 xg离心10分钟，然后除去水相。在相同条件下，再用0.5 ml的ddH 2 O 洗涤。
注意：洗涤步骤通常包括：加入溶剂，涡旋2分钟，并且在离心分离机2 ，000×g离心10分钟（RT）。

获得大约4-5毫升的总脂质溶液，可以在-20℃下保存 °C两周或继续下一步。
将5 ml脂质溶液转移到250 ml茄子形烧瓶中。
将烧瓶放在旋转蒸发仪上5-10分钟，以除去有机相（50 °C ），并在茄子形状的壁上形成超薄的姜脂膜（图2）。
注意：适当的转速是4（10个转速）。

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图2. 通过旋转蒸发在茄子形烧瓶的底部表面形成脂质薄膜（红色箭头指示）

通过薄膜水化生成姜衍生的脂质囊泡（GDLV）siRNA复合物
将3.75 nmol的目标siRNA或阴性对照-siRNA溶解到300 将 μl 无菌5％葡萄糖溶液放入单独的烧瓶中，轻轻涡旋（10 s）。
向siRNA的葡萄糖溶液中加入6 ml TurboFect TM 试剂，轻轻涡旋（10 秒），并在室温下孵育15分钟。
将siRNA / TurboFect 葡萄糖溶液加入装有姜脂膜（1.6 mg GDNPs）的烧瓶中。
加入500 μ 升20 毫HEPES缓冲液（pH 7.4）中。
在室温下用移液器超声（约42 KHz）5分钟。
加入500 μ 升20 毫HEPES缓冲液（pH 7.4）。
将悬浮液超声处理5分钟（图3）。

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图3. 超声处理后GDLV / siRNA 复合体的形成

用大小分析仪测量GDLV / siRNA复合体的大小。
注意：使用1x PBS（RT）进行准确的尺寸测量。

在约55°C下通过AVESTIN脂质体挤出机（具有200 nm聚碳酸酯膜）挤压悬浮液约19-21次。
将纳米颗粒用5 ml高压灭菌的1x PBS悬浮以进行下一步，或将其保存在-80 °C 以便将来使用（注3）。

表征siRNA的GD NPs（GDLVs / siRNA复合物）
siRNA加载效率测试

在TE缓冲液中将5 µg GDLVs / siRNA复合物稀释至1 ml的最终体积。
加入1ml Quant-的智达RIBOGREEN REA 绅士。
孵育5分钟在室温下在溶液中黑暗条件下。
用酶标仪测量样品的荧光（激发480 nm，发射520 nm）。

GDLVs的结肠特异性靶向（体内生物分布）评估

在室温下用DiR 染料（10 uM ）将5 ml GDLV（0.1-1 mg / ml 在PBS中）孵育30分钟。
传输解决方案的Amicon ® 超15离心过滤器。
在过滤离心机在4 ℃下，5 ，000 ×g下30分钟。
在管的顶端取DiR 标记的GDLV。在5 ml PBS溶液中重建DiR 标记的GDLV 。
制备两组的12小时-fasted FVB小鼠（6周龄，雌性，n = 3）。
在不同的时间点（4、8、12和24小时），对一组禁食12小时的小鼠灌胃单剂量的DiR 标记的GDLV（0.3 mg / ml ）。
牺牲两组老鼠，并收集各种器官（心脏，肝脏，脾脏，肺，胃，小肠，结肠和肾脏）的组织样本。
采取离体使用IVIS Spectrum系列的器官的荧光图像的体内成像系统（荧光激发在750纳米，在800nm处发射）。
比较经过处理和未经处理的小鼠器官样本之间的荧光图像。
注意：理想情况下，结肠组织将在具有DiR 标记的GDLV的小鼠的12和24 h 样品中呈现高荧光强度（> 2.5 x 10 7 辐射效率）。

测试功能性siRNA的递送（体内转染）

将100μlGDLVs / siRNA溶液（0.5 nmol / ml在PBS中）灌胃两次（间隔12小时）给小鼠。
48小时后，处死小鼠并收集肠道组织以进行即时测试，或将组织储存在-80 °C下。
对肠道中不同部位的CD98 mRNA进行标准实时qPCR，包括十二指肠，空肠，回肠和结肠。
比较用或不用CD98 siRNA处理的小鼠的不同样品中的CD98 mRNA表达。
注意：CD98 mRNA的一个成功的击倒将在10,000 TI抑制CD98与剂量的mRNA表达的80％以上的MES比裸CD98的siRNA降低（ř EFER至Zhang等人，2017年。）。

GDLV / siRNA复合物的表征
测量粒度

将0.2 ml GDLV / siRNA复合物溶液稀释到1.8 ml PBS中。
小心地将稀释的混合物添加到比色杯中，避免产生气泡。
将比色皿插入颗粒分析仪室。
确定粒子的大小。

测量ζ电势

注意：Zeta电势是一个重要的特征，反映了颗粒的表面化学性质。

小心地将0.8 ml GDLV / siRNA混合物添加到毛细管中。
用塑料盖盖住毛细管。
将电池插入zeta电位分析仪的腔室。
在中性pH下测量Zeta电位值。

获取透射电子显微镜（TEM）图像

将1 µl GDLVs / siRNA样品直接沉积在Formvar涂层网格的表面上。
在样品顶部添加5 µl 1％乙酸铀酰，并等待15 s。
用一次性擦拭器小心吸收样品和乙酸铀酰，不要接触表面。
让样品在室温干燥30分钟。
用透射电子显微镜扫描样品。

采集原子力显微镜（AFM）图像

沉积5 微升GDLVs / siRNA的样品的云母片。
将样品干燥2小时（在室温下）。
轻轻RINS 三次e是云母片各自具有20 μ 升的蒸馏水中。
在室温下再干燥样品2小时。
在室温下放置30分钟，直到样品变平。
具有约4×4的区域扫描样品μ 米，高度为2-50纳米。
注意：要判断样品是否干燥并且变平，我们可以将云母片放置在垂直位置，如果没有观察到样品点有水流的迹象，则通常意味着样品是平坦且干燥的。

数据分析

TEM和AFM图像显示GDLV是纳米尺寸的颗粒，具有球形形状（图像可从Zhang 等人的图2中找到，2017年）。
动态光散射分析显示其直径约为189.5 nm，ζ 电位在-18.1至-18.4 mV之间变化（相关数据可在Zhang 等人的补充数据中找到，2017年）。
siRNA负载的效率根据由Quant-提供的标准曲线计算智达RIBOGREEN 制造商。使用标准荧光波长测量样品的荧光，激发波长为480 nm，发射波长为520 nm。

记事簿

推荐使用HPLC纯化的siRNA，因为当施用于动物模型时，它们更稳定且毒性更低。
用100％乙醇清洁茄子形烧瓶，并完全除去残留的液体，以防止破坏纳米颗粒的形成。
超离心（30,000 xg ，4 °C和45分钟）并去除上清液后，可以富集储存的纳米颗粒（在1x PBS中）。

菜谱

1％乙酸铀酰溶液
将4 g醋酸铀酰粉末溶解于100 ml预热（50-60 ° C）的过滤水中以制备4％醋酸铀酰储备溶液
接下来，将1 ml 4％乙酸铀酰原液稀释到3 ml过滤水中
5％葡萄糖溶液
将1 g葡萄糖溶于200 ml ddH 2 O中并充分混合

致谢

这项工作得到了美国糖尿病，消化与肾脏健康研究所（DM的RO1-DK-071594）的支持。这项工作是从张等人改编和修改。，2017年。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

所有的实验进行了涉及小鼠，在乔治亚州立大学（亚特兰大，GA，USA）机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

参考资料

Nikam ，RR和Gore，KR（2018）。siRNA之旅：临床发展和靶向交付。核酸THER 28（4）：209-224。
Sung，J.，Yang，C.，Viennois ，E.，Zhang，M.，and Merlin，D.（2019年）。分离，纯化，和表征从生姜，根状茎生姜衍生的纳米颗粒（GDNPs）的生姜。生物协议9（19）：e3390。
Tatiparti ，K.，Sau，S.，Kashaw ，SK和Iyer ，AK（2017）。siRNA递送策略：最新进展的全面综述。纳米材料（巴塞尔）7（4）。
Zhang，M.，Viennois ，E.，Prasad，M.，Zhang，Y.，Wang，L.，Zhang，Z.，Han，MK，Xiao，B.，Xu，C.，Srinivasan，S.和Merlin ，D.（2016a ）。可食用的生姜纳米颗粒：预防和治疗炎症性肠病和结肠炎相关癌症的新型治疗方法。生物材料101：321-340。
Zhang M.，Viennois E.，Xu C.和Merlin D.（2016b ）。植物来源的可食用纳米颗粒是一种抗疾病的新治疗方法。组织壁垒4（2）：e1134415。
Zhang M.，Wang X.，Han MK，Collins，JF和Merlin D.（2017年）。口服含siRNA的生姜纳米脂质作为有效siRNA药物递送治疗溃疡性结肠炎的新方法。纳米医学（伦敦）12（16）：1927-1943。