材料和试剂

1. 微Ç 超过克lasses，- [R ound，没有。1 ，18毫米（VWR ® 国际，目录号：CA-48380-046），小号teriliz È 盖玻片使用高压釜

2. 显微镜载玻片（Fisherbrand ，Fisher Scientific，目录号：12-550-15）

3. 清除组织培养处理的12孔微量培养板（Costar公司康宁® ，Millipore公司-Σ，C atalog号：CLS3513）

4. 封口膜

5. 纸巾

6. 细胞系：LLC-PK 1 肾小管上皮细胞系（欧洲认证细胞培养物保藏中心（英国索尔兹伯里），目录号：86121112）

7. 对于细胞培养e：

Dulbecco改良的Eagle培养基（D-MEM），低糖，含L-谷氨酰胺
110 mg / L 丙酮酸钠（Thermo Fisher ，Gibco，目录号：11885084）
10％胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher，Gibco，目录号：12483-020）
1％青霉素-链霉素（青霉素-链霉素，100 x ，无菌过滤，经过细胞培养测试）（Millipore-Sigma Aldrich，目录号： P-4333）
胰蛋白酶-EDTA（0.05％胰蛋白酶与EDTA 4Na）（Thermo Fisher，Gibco，目录号：25300062）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher，Gibco，目录号：10010023）
8. 蛋氨酸hanol（BioShop 加拿大，目录号：Met302），Ç OOL至-20 ° 下用前

9. 10X PBS缓冲液（pH 7.4的无菌，W / O型的Ca，Mg）的（BioShop 加拿大，目录号：PBS415）ö 笔在罩保持用于存储无菌

10. 牛血清白蛋白（BSA）（馏分V，热休克隔离度，> 98％）（加拿大BioShop ，目录号：ALB001）

11. 多克隆兔抗紧密连接蛋白-2抗体（赛默飞世尔科技，Invitrogen，目录号：28530），一个liquot以避免反复冻融，储存在-20 °C

12. 荧光团标记的二抗：

用Alexa Fluor 488标记的驴抗兔IgG（绿色）（Thermo Fischer Scientific，目录号：A-21206）

要么

用Alexa Fluor 555（红色）标记的驴抗兔IgG（Thermo Fischer Scientific，目录号：A-A31572）

13. 2,4-二mid基-2-苯基吲哚（DAPI）（Thermo Fischer Scientific ，目录号：D1306）

通过将一个小瓶（10 mg）的内容物溶解在2 ml去离子水中制成5 mg / ml DAPI储备溶液。分装库存，避光。DAPI储备溶液可以在4 °C下保存长达6个月，或在-20°C下保存更长时间。

14. 荧光封固介质（Dako公司，安捷伦目录号：S3023），小号撕在4℃下

15. 细胞培养基（请参阅食谱）

16. 1x PBS（请参阅食谱）

17. 阻塞缓冲区（请参见食谱）

18. 抗体缓冲液（请参阅食谱）

设备

镊子
尼康E Clipse TS100显微镜
WaveFX 旋转盘共聚焦显微镜（Quorum Technologies，加拿大圭尔夫），带有带有第二代sCMOS 图像传感器的ORCA-flash4.0数码相机

软件

变形图像分析软件，分子设备
Imaris 软件8.0.2（Bitplane ）

程序

盖玻片上接种细胞
生长LLC-PK 1个细胞在培养基中的T75烧瓶（低葡萄糖DMEM补充有10％FBS和1％青霉素-链霉素，见ř ecipes）在含5％CO的培养箱2 。使用生长至约90％汇合的LLC-PK 1 细胞烧瓶。根据标准细胞培养程序，用5-8 ml PBS 冲洗并添加1-2 ml 胰蛋白酶。放回培养箱约10分钟，直到细胞漂浮。需要注意的是培养的细节必须为特定的细胞系进行调整。
当细胞处于胰蛋白酶中时，使用无菌将高压灭菌的盖玻片置于多孔板中镊子。
当细胞漂浮时，将其重悬于8 ml 新鲜培养基中，混合均匀，将等量的细胞接种到盖玻片上。在1 ml培养基/孔（12孔板）中使用2 x 10 5 -5 x 10 5 / ml细胞。
轻轻摇动培养皿，使细胞均匀分布并放入培养箱中。
使细胞生长至100％融合（约48小时）。值得注意的是，我们发现亚融合细胞培养物中Cldn-2的表达较低，并随着细胞融合而增加（Amoozadeh et al。，2018）。因此，在进行免疫染色之前，使细胞完全融合并产生成熟的TJ非常重要（请参见图1）。

D：\重新格式化\ 2020-4-7 \ 1903016--1411 KatalinSzászi832528 \图jpg \图1.jpg

图1. š ubconflue NT （甲）和汇合（乙）LLC-PK 1个培养物。使用Nikon eclipse TS100显微镜（10倍物镜）获得在盖玻片上生长的活细胞的相差图像。

固定
根据实验的需要，治疗的细胞例如，用细胞因子。在治疗结束时，吸出培养基并用1x PBS快速冲洗。漂洗后的步骤无需在无菌条件下执行。用于培养细胞的多孔皿可以在非无菌条件下用于染色方案。
立即用0.5-1 m L 甲醇（储存在-20°C）固定PBS和抽吸液5分钟。确保甲醇完全覆盖了防护玻璃。这两个步骤应尽快完成。
用1x PBS洗涤5次。完成此步骤后，如果需要，可以将样品在4°C下保存过夜。但是，我们希望立即进行后续步骤。不建议更长的存储时间。

阻塞，染色和安装
用0.5块- 1米升的PBS封闭缓冲液在室温下1个小时。确保缓冲液完全覆盖了防护玻璃。
一抗孵育：
在抗体缓冲液中稀释抗体1：100。
为了减少抗体的使用，将50μl 稀释的抗体放在封口膜上，并将盖玻片的细胞面向液滴。避免产生气泡，也不要让玻璃盖变干。在室温下孵育1小时。
非特异性二抗结合控制：使用其中一个盖玻片证明二抗的特异性。省略一抗，但类似地执行所有其他步骤。
一抗特异性的对照样品：使用Cld n -2被沉默或敲低的样品（Dan 等，2019）。
孵育结束后，用镊子将盖玻片放回同一培养皿中，使细胞向上。用1x PBS洗涤5次。
二级抗体孵育：
在抗体缓冲液中稀释二抗（1：1,000）和DAPI（1：5,000）。
加入500 微升的抗体溶液到盖玻璃。
在黑暗中于室温下孵育1小时。
在15分钟内用1x PBS洗涤5次。
标记显微镜载玻片以识别样品。将一滴荧光固定剂放在显微镜载玻片上。使用镊子提起防护玻璃罩，将边缘碰到纸巾上，以去除多余的液体。将沾有污渍的盖玻片放在荧光固定介质滴上，并使细胞朝下。避免气泡。吸入流体。
在成像或存放之前，让荧光固定剂干燥至少30分钟。将干燥的载玻片在4°C下黑暗保存

使用共聚焦显微镜可视化
设置共聚焦显微镜
设置（例如，激光，目标等）将根据您的实验而异。我们使用63倍物镜，其目的是为了提供所需的分辨率和成像场的大小。
选择第二抗体（在我们的实验中为Alexa488或555）和DAPI的荧光团的激发/发射设置。
选择曝光时间以避免图像饱和。通过定义顶部和底部焦平面位置以及大约2μm （12-16个焦平面）的步长，在整个样本的两个波长下获得z堆栈截面。
可以使用堆栈TJ级别的单个平面进行显示。但是，单层中的LLC-PK 1 细胞通常具有微小的高度差异，也可以形成圆顶。这会导致视野不同区域中的TJ位于稍微不同的焦平面上，从而使某些区域失去焦点。此外，TJ 定位的和细胞内的Cldn-2也位于不同的焦平面中。要可视化细胞内的所有Cldn-2，请使用Metamorph 从z堆栈生成最大强度投影（示例请参见图2）。Ť ħ 是亲塞斯使用最亮像素从每个层，并显示其在最终图像中的强度值，从而允许折叠成2D画面的3D图像的可视化。处理过程必须在手稿中披露。
C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-7-20 \ 3678--1903016--1411 KatalinSzászi832528 \ Figs jpg \ Fig 2.jpg

图2. LLC-PK 1 细胞中典型的Claudin-2染色。将LLC-PK 1 细胞用甲醇固定，并按照方案中所述对Cldn-2进行染色。用DAPI 对细胞核染色。使用共聚焦显微镜对每种染色获得Z轴，使用Metamorph 软件生成最大强度的投影图像。将针对两个波长获得的图像进行合并。条形代表10μm 。

数据分析

图像p rocessing和d ATA 一个nalysis ：

Imaris的3D重建
为了量化总Cldn-2染色的强度，我们使用Imaris 软件进行3D重建，然后将其用于量化。值得注意的是，以上生成的最大强度投影图像无法用于量化。为了基本了解Imaris 软件，请访问http://www.bitplane.com/learning上的免费在线教程。

将z-stack图像上传到Imaris 8.0.2软件。
点击“编辑/添加频道”，然后选择适当的图像。
在主菜单中，选择“替代/添加新曲面”，然后点击“ 创建曲面” 。
选择适当的“曲面区域细节级别”。选择“绝对强度”作为阈值。
注意：这两个设置都是自动计算的，但是，用户可以更改这些参数。在整个图像分析中，请保持这些设置不变。

单击“完成”以完成堆栈的3D重建。
通过添加新的斑点对象，创建3D斑点对象以量化核数。
选择“不同的光斑尺寸” 。
对于“源通道”，选择DAPI 通道。
对于“斑点检测”，输入原子核的“估计的XY直径和Z直径”。
手动调整“斑点质量”以包括任何未检测到的核。
选择“强度最大值=细胞轮廓的遮罩通道数”以限制额外的核斑点。请注意，所有描述的参数的值取决于所获取图像的属性，并且在特定图像中会有所不同。
调整“斑点区域阈值”，并确保检测到所有核斑点。
单击“完成”以完成对核斑点的检测。
选择所需的统计参数（斑点的数量和总数）并导出.csv文件。这些可以使用图形程序打开。

数据与分析
使用一个图形程序（Excel或的GraphPad）来计算每个表面（的体积总和微米3 ）。
将数据表示为每个细胞的总表面体积（核斑）。

记事簿

细胞系选择：我们使用的LLC-PK 1 细胞系起源于欧洲已认证细胞培养物保藏中心。这LLC-PK 1 克隆本来也可以在ATCC（ATCC ® CRL-1392 TM ），但是已经停产。ATCC分布另一种LLC-PK 1 细胞系，但是，我们发现来自各种来源的LLC-PK 1 细胞的claudin-2表达水平有所不同。因此，在为该项目选择细胞系之前，应验证目标claudin的良好表达。
细胞计数和融合：随着层的融合，TJ 逐渐发展，因此建议使用完全融合的层。Claudin-2的总表达在亚汇合细胞中低，并随着汇合的发展而增加。比较不同条件时，汇合度应保持恒定。我们发现，当在培养和接种过程中持续应用相同的条件时，细胞数可以保持恒定。因此，在建立协议之后，不需要常规的细胞计数。但是，实验操作可能会改变细胞生长，因此应常规检查融合度，并将其视为重要变量。
在整个染色过程中，必须避免干燥盖玻片。
这里描述的协议用于染色claudin-2。可以使用相同的协议来可视化任何上皮细胞系中的其他连接蛋白。我们发现固定模式是良好保存和可视化连接蛋白的关键。当对claudins染色时，使用甲醇获得了良好的结果。对于occludin，我们使用丙酮固定。对于这些固定方法，不需要其他通透性。有关用于连接蛋白的各种固定方法的详细分析，请参阅Buckley 等。，2018 。
所描述的量化不是针对TJ定位的claudin-2，而是反映了总claudin-2的丰度，包括胞质蛋白。在我们的实验中，定量用于对照和TNF-α处理的样品之间的比较。相对于对照（未处理），数据表示为染色/细胞，以表明倍数变化。在这种情况下，对照未经处理的样品用作参考。对于其它类型的比较（例如，未经处理的样品的比较），参考蛋白质，例如，另一个TJ蛋白应使用（例如，costaining 用于闭合蛋白或ZO-1和表达紧密连接蛋白2的比率，以闭合蛋白染色）。基准的选择然而可以构成为细胞因子处理的样品的困难，因为我们发现，我们测试的所有TJ蛋白的表达（例如，其他密蛋白，闭合蛋白），以及所述粘着连接蛋白E-钙粘均改变由TNFα （Amoozadeh 等人，2015）。因此，在选择参考之前，重要的是要表明它不受治疗的影响。最后，应通过其他定量方法（例如s Western印迹）验证定量。

菜谱

细胞培养基
低糖，含L-谷氨酰胺和110 mg / L 丙酮酸钠的Dulbecco改良Eagle Eagle培养基（D-MEM）补充有10％胎牛血清（FBS）和无菌过滤的1％青霉素-链霉素

1x PBS
从10x PBS稀释：将50 ml 10x PBS加入450 ml蒸馏水2 O中

阻塞缓冲区
3％BSA和PBS

混合1.5克BSA和50毫升PBS
短期存放（1天）于4°C
经度不推荐克长期储存

抗体缓冲液
0.3％BSA和PBS

混合0.15 g BSA和50 ml PBS
短期存放（1天）于4°C
经度不推荐克长期储存

致谢

资金来源：加拿大肾脏基金会，加拿大卫生研究院（CIHR）授予PJT-149058和MOP-142409。

该协议源自：Amoozadeh 等。，2015年和2018年；Dan 等。，2019 。

利益争夺

作者宣称他们没有财务或非财务利益冲突。

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