材料和试剂

1. 100-1000µl移液管尖端（Biosharp，目录号：BS-1000-T）

2. 微型离心管，5 ml（Biosharp，目录号：BS-50-M）

三。一次性无菌注射器三。一次性无菌注射器，1ml（郑州康佳医疗设备有限公司）

4. 透明短线广口样品瓶，2ml，带贴片的小瓶（32*11.6mm）（安捷伦科技，5182-0715）目录号：

5. 蓝色螺帽（9毫米）（安捷伦科技公司）目录号：5182-0717

6. 一次性使用无菌针式过滤器，尼龙66，孔径：0.22μm（天津赛柏实验设备有限公司，产品目录号：SFNF1322）

7. 小鼠粪便样本，收集后于-20存放摄氏度

8. 盐酸，37%（v/v）（天津丰川化学试剂技术有限公司CAS:7647-01-0）

9. 乙酸，气相色谱标准，≥99.8%（GC）（阿拉丁工业公司，目录号：A116165）

10. 丙酸，气相色谱标准，≥99.5%（GC）（阿拉丁工业公司，目录号：P110443）

11. 丁酸，气相色谱标准品，>99.5%（气相色谱）（阿拉丁工业公司，目录号：B110439）

12. 异丁酸，气相色谱标准，≥99.5%（GC）（阿拉丁工业公司，目录号：I103521）

13. 戊酸，气相色谱标准，≥99.5%（气相色谱）（阿拉丁工业公司，目录号：V108269）

14. 异戊酸，GC标准，≥99.5%（GC）（阿拉丁工业公司，目录号：I108280）

15. 乙酸乙酯，分析纯度≥99.5%（天津富晨化学试剂有限公司）

161M盐酸溶液161M盐酸溶液（见配方）

17. SCFAs单一标准溶液（见配方）

18. SCFAs混合标准溶液（见配方）

19. 用稀释系数为2、4、8、10倍稀释SCFAs单标准溶液（见配方）

20. SCFAs混合标准溶液（见配方）

21. 用2、4、8、10倍稀释倍数稀释SCFAs混合标准溶液（见配方）

设备

1. 50毫升容量瓶

2. 烧杯

3. 100-1000µl移液枪（Eppendorf，型号：research plus）

4. 气相色谱仪（安捷伦7890A，美国），配有火焰离子化检测器和自动取样器（自动进样器，型号：7683B）

5. DB-FFAP毛细管柱，以对苯二甲酸改性聚乙二醇为固定相（30 m x 320µm x 0.5µm）（安捷伦科技，美国，目录号：123-3233）

6. 不锈钢勺，长180mm，最宽直径3mm

7. 分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，型号：ME204/02）

8. 涡流混合器（奥兰科技股份有限公司，型号：SI-0246-G560E）

9. 离心机（长沙高新区湘仪离心机有限公司，型号：H1650R）

10. 超声波清洗机（昆山河创超声波仪器有限公司，型号：KH-500E）

软件

1. 安捷伦化学站用于分析数据（B.0403）

程序

A、样品收集

1. 选择6-8周时生长状况相似的小鼠。

2. 收集12只小鼠的粪便样本，每个样本约300毫克（储存于-20摄氏度）。用于测定SCFAs和回收率。

3. 充分混合12个样品，称取约100 mg混合样品，并将其置于5 ml离心管中。对22个样品重复称重。用其中的三个平行测试scfa，并用剩下的19个来确定恢复率。编号并记录样品质量（储存在-20°C下）。

B、样品预处理

1. 将所有生物样品冷冻在-20°C，直到分析当天。

2. 向每个样品中加入3ml盐酸1ml，涡流1分钟，充分搅拌，直到没有明显的结块。

3. 将搅拌好的离心管放入烧杯中的冰水浴中，超声提取10分钟（见视频1）。将温度设置为室温，频率为40kHz。

视频1。冰水浴

4. 在4°C，9710 x g下离心分离样品15分钟。

5. 用移液管将1毫升上清液转移到5毫升离心管中（见图1）。

图1。吸收上清液

6. 向上清液中加入1ml乙酸乙酯，倒置离心管，使上清液完全混合（见视频2）。

视频2。提取

7. 在4°C，9710 x g下离心分离样品15分钟。

8. 用一次性无菌注射器吸取上清液，用0.22μm有机滤膜过滤。将过滤后的上清液转移至澄清的短线大口样品瓶中，注入气相色谱分析（如果瓶内储存的样品不能尽快分析，可在-20°C下保存1-2天）（见图2）。

图2。吸取上清液并过滤

C、气相色谱（GC）实验条件

根据表1所述条件设置GC程序。

表1。气相色谱实验条件

GC程序

条件设定

色谱柱

DB-FFAP（详见设备）

入口温度

250摄氏度

注入量

1微升

分流比

1： 1

载气类型

氮气

载气速度

2毫升/分钟

烘箱温度条件

将烘箱温度程序调至90°C，保持5分钟，并以20°C/min的速率升至200°C，保持3分钟。

氢火焰离子化检测器

250摄氏度

氢气流量

40毫升/分钟

合成空气流量

450毫升/分钟

样本针清洗

乙酸乙酯

D、标准品制备及准确度分析

1制备SCFAs单标准溶液：以乙酸乙酯为溶剂，将乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸的最大浓度分别调整为2、0.5、0.1、0.5、0.5和0.1g/L（具体操作见配方2）。1制备SCFAs单标准溶液：以乙酸乙酯为溶剂，将乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸的最大浓度分别调整为2、0.5、0.1、0.5、0.5和0.1g/L（具体操作见配方2）。

2. 用乙酸乙酯稀释最高浓度的混合溶液2、4、8和10次（具体操作见配方3）。

3. 配制SCFAs混合标准溶液：以乙酸乙酯为溶剂，将混合溶液中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸的最大浓度分别调整为2、0.5、0.1、0.5、0.5和0.1g/L（具体操作见配方4）。

4. 用乙酸乙酯将最大浓度的混合溶液稀释2、4、8和10次（具体操作见配方5）。

5. 将SCFAs按浓度梯度（表2）注入GC中，测定SCFAs的校准曲线。

表2。6 SCFAs标准溶液浓度

水平

醋酸

（克/升）

丙酸

（克/升）

异丁酸

（克/升）

丁酸的

（克/升）

缬草

（克/升）

缬草

（克/升）

1

2

0.5

0.1

0.5

0.5

0.1

2

1

0.25

0.05

0.25

0.25

0.05

3

0.5

0.125

0.025

0.125

0.125

0.025

4

0.25

0.0625

0.0125

0.0625

0.0625

0.0125

5

0.2

0.05

0.01

0.05

0.05

0.01

6. 用外标法建立校正图，根据标准曲线求出R2，以确定精度。

7. 采用气相色谱法对SCFAs标准溶液（6种乙酸、丙酸等）进行了从高到低的顺序分析。通过对GC工作站软件的分析，得到了标准SCFA的信噪比（S/N）。

E、恢复

1. 用标准加入回收法计算回收率。（Park等人，2018年）

2. 从“A.样品采集”中抽取19个样品，以测试回收率。

3. 取18个样品作为平行实验，另一个作为空白对照，不经任何处理。

4. 以6个样品为一组，加入1ml表2中1级SCFAs标准溶液。再次选择6个样品作为一组，加入1ml表2中第3级SCFAs标准溶液。然后选择6个样品作为一组，加入1ml表2中5级的SCFAs标准溶液。目的是检查回收率的准确性。

5. 按照样品预处理（程序B）处理19个样品。

6. 根据气相色谱实验条件对样品进行分析。

7. 根据SCFAs的标准曲线得到SCFAs的含量。

F、样品分析

采用气相色谱法对3个样品进行分析，根据各种短链脂肪酸的标准曲线，可以得到样品中SCFAs的含量。

数据分析

A、 SCFAs的气相色谱分析

1. 用气相色谱法测定SCFA的标准值。根据气相色谱法得到的单一标准物质的峰时，可以确定混合标准物质中每种物质的峰时。

2. 结果如图1所示（Zhang等人，2019年）。每个洗脱液应清晰分离，峰的形状清晰对称。溶剂乙酸乙酯峰为5min，乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸的峰时间分别为7.886、8.531、8.724、9.174、9.472和9.998min。

3. 总气相色谱分析时间为13.5min。

B、线性和灵敏度

1. 根据每个SCFA的S/N值确定LOD和LOQ。

2. 标准SCFA的信噪比（S/N）分别为3和10，分别作为每个SCFA的检测限（LOD）和定量限（LOQ）。

3. 结果应与表1几乎相同（Zhang等人，2019年）。

C、回收率和准确度

1. 结果应与表2几乎相同（Zhang等人，2019年）。

2. 根据GC分析结果中SCFAs的峰面积和SCFAs的标准曲线，得到空白样品中SCFAs的含量。

3. 使用以下公式计算回收率：

式中，R为回收率，%；C1为标准加入物和样品中SCFAs的浓度；C2为样品中SCFAs的浓度；C3为标准加入物中SCFAs的浓度。

笔记

1. 本实验选用6～8周龄的幼鼠。此时小鼠各脏器发育成熟，健康指数良好。在随后的1-2个月的实验周期内，小鼠处于健康状态。

2. 在样品采集环节，小鼠粪便称重后，避免样品反复冻融。在-20°C下储存有两个好处：一是将样品冷冻成团块以便称重；二是减少粪便中物质的挥发。

3. 收集老鼠粪便的方法有很多种。本文选择了一种处理刺激的方法。操作方法如下：先将老鼠固定，抬起尾巴，然后用手指按压老鼠下腹，用微型离心管收集新鲜粪便，存放在-20°C。

4. 样本数量不是一个严格的要求。应根据具体的实验条件进行判断。本文选取12个样本的目的是尽可能增加样本选择的随机性，使实验结果更加准确。如果有明确的实验组样本，样本量就是实验组样本数。关于小鼠粪便的数量，有必要判断一次试验至少100毫克。如果测试6种SCFA的回收率，并且在一种SCFA中加入三种不同浓度的SCFA标准溶液，则需要测试18次。当最终检测出样品中的SCFAs时，保证准确度，测试3次，取平均值，并包括空白组，这样一个系统运行需要测试22次，保守要求2200mg。在计算称重和其他实验过程中的损失时，至少收集了3000毫克。

5. 当使用1 M HCI时，根据配方配置新试剂。不要使用很久以前配置的试剂

6. 混匀时用离心机将混匀的样品盖紧，防止混匀后混匀的HCl管流出。

7. 表面结块的原因是样品在预处理过程中被冻结，可能会结块。另一种可能是粪便样本本身有结块，需要摇动以分离结块，并用盐酸充分反射。

8. 冰水浴超声波处理时，应及时加冰维持温度。

9. 使用吸液枪的目的是操作简便、灵敏，并随时控制吸力。

10. 在萃取操作中，离心管需要上下颠倒几次，以使上清液与乙酸乙酯充分反应。这一步持续3分钟。

11. 注意液面分界线，不要过度吸气。一次性注射器对操作不够敏感，应特别注意。或者，用移液管将上清液转移到另一个试管中，然后进行过滤，以避免干扰沉积物或底层。

12. 用0.22μm有机滤膜过滤上清液时，要控制针管压力，防止滤膜破裂。

13. 配置单一标准溶液或混合标准溶液时，尽量配置大容量或高浓度溶液，以减少溶液配制过程中的浓度误差。

14. 当进行梯度稀释操作时，选择适当的容量瓶进行定容。

15. 根据小鼠粪便中SCFAs的含量，确定了单一标准溶液或混合标准溶液中SCFAs浓度的设定范围。

16. 分析单一标准溶液的目的是确定混合标准溶液中每种物质的种类。

17. 由于气相色谱进样体积很小，在进行梯度稀释时，可以选择小容量的容量瓶来定容，目的是减少溶液的浪费。

18. 在分析单一标准溶液时，可以选择从低浓度到高浓度的顺序，我们只需要得到峰时间。

19. 每种分析物的保留时间和检测范围可能因毛细管柱类型、长度和设备品牌而异。

食谱

11 M HCl溶液（100 ml）11 M HCl溶液（100 ml）

将8.35 ml HCl 37%（v/v）放入100 ml容量瓶中

加入蒸馏水定容至刻度

2. SCFAs单一标准溶液（100毫升）

乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸的最高浓度分别为2、0.5、0.1、0.5、0.5和0.1 g/L（标签号为1）

气相色谱法测定乙酸含量≥190.8%

50.51µl分析标准丙酸，气相色谱测定≥99.8%

10.53µl分析标准异丁酸，气相色谱测定≥99.8%

52.08µl分析标准丁酸，气相色谱测定≥99.8%

53.72µl分析标准异戊酸，气相色谱测定≥99.8%

10.65µl分析标准戊酸，气相色谱测定≥99.8%

分别向100ml容量瓶中加入乙酸乙酯定容。（将六种单一标准溶液分别置于六个容量瓶中）；旋涡1分钟

在方程式中，是物质的密度，g/ml；m是物质的质量，g；v是物质的体积，ml

3. 用稀释系数为2、4、8、10倍稀释SCFAs单标准溶液

稀释2次：准确吸取1号溶液25ml，加入50ml容量瓶中，加乙酸乙酯至刻度。（标签为2号）

稀释4次：准确吸取2号溶液25ml，加入50ml容量瓶中，加乙酸乙酯至刻度。（标签为3号）

稀释8次：准确吸取25ml 3号溶液，加入50ml容量瓶中，加乙酸乙酯至刻度。（标签为4号）

稀释10倍：准确吸取1号溶液5ml，加入50ml容量瓶中，加乙酸乙酯至刻度。（标签为5号）

4. SCFAs混合标准溶液

醋酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸混合储备液的最高浓度分别为2、0.5、0.1、0.5、0.5和0.1g/L（标签号为No.6）

190.48µl分析标准乙酸，气相色谱测定≥99.8%

50.51µl分析标准丙酸，气相色谱测定≥99.8%

10.53µl分析标准异丁酸，气相色谱测定≥99.8%

52.08µl分析标准丁酸，气相色谱测定≥99.8%

53.72µl分析标准异戊酸，气相色谱测定≥99.8%

10.65µl分析标准戊酸，气相色谱测定≥99.8%

向100ml容量瓶中加入乙酸乙酯，定容（将六种单一标准溶液放在一个容量瓶中），涡旋1分钟

5. 用2、4、8、10倍稀释倍数稀释SCFAs混合标准溶液

稀释2次：准确吸取6号溶液25ml，加入50ml容量瓶中，加乙酸乙酯至刻度。（标签为7号）

稀释4次：准确吸取7号溶液25ml，加入50ml容量瓶中，加乙酸乙酯至刻度。（标签为8号）

稀释8次：准确吸取8号溶液25ml，加入50ml容量瓶中，加乙酸乙酯至刻度。（标签为9号）

稀释10倍：准确吸取6号溶液5ml，加入50ml容量瓶中，加乙酸乙酯至刻度。（标签为10号）

致谢

本研究得到了天津市微生物代谢与发酵过程控制工程研究中心（编号：ZXKF20180304）的资助。

相互竞争的利益

所有作者都声明不存在利益冲突。

伦理学

遵守所有适用的国际、国家和/或机构的动物护理和使用指南。

我们用动物粪便做实验。动物不是我们的。它们是其他研究小组提供给我们的样本。

工具书类

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