材料和试剂

用料
35毫米组织培养皿（Falc on，目录号：351008）
玻璃底培养皿（35毫米培养皿，第1.0号; MatTek ，目录号：P35G-1.0-14C）
用于注入小鼠胚胎的mRNA合成的质粒模板：pCS2 + -H2B -pr-mEosFP （Addgene 质粒＃141101 ）。含有pr-mEosFP 的质粒可以在Addgene （Addgene 质粒＃99213 ）上找到。

试剂种类
EmbryoMax M2培养基（Millipore，目录号：MR-015-D）
EmbryoMax KSOM培养基（Millipore，目录号：MR-020P-5F）
矿物油（西格玛，目录号：M8410）

设备

CO 2 培养箱（活页夹，型号：CB160）
Ç onfocal显微镜（Zeiss LSM 780）与非线性光学（NLO ）（钛：蓝宝石）激光在连续波（CW ）模式（相干变色龙超II）
d issection显微镜（莱卡M205C ）
涂有底漆的转换滤板（请参见Mohr 等人，2016年）以进行详细设置，可以在德国AHF Analysentechnik公司订购单个零件
LS1活光片显微镜系统（Viventis Microscopy Sarl ，瑞士）。

软件

ZEN软件（Zeiss）
Imaris 8.4版（Bitplane ）
MATLAB（MathWorks）

程序

小鼠植入前胚胎中单核的封闭引发转化
提前一天按照制造商的说明制备KSOM培养基，并使其在37°C 的CO 2 培养箱中平衡过夜。
玻璃底成像准备菜肴〜2 MYU 大号滴KSOM覆盖矿物油，让它的CO 2 孵化器，直到使用。
一个样品架准备用〜10-15 Myu L KSOM盖上〜300 Myu L 矿物油的LS1光学显微镜，并将其放在CO 2 培养箱中直至使用。
与photoconvertible蛋白标记的培养的胚胎（通过显微注射mRNA的成ZYGO TES或2-细胞期胚胎中描述以前LY（Plachta 等人，2011），或转基因系）体外在15-25 微升KSOM的降在37°C和5％CO 2 的培养条件下，用矿物油覆盖至所需的发育阶段，在该阶段中您要转换单核。
如Mohr Et Al。（2016）所述，设置用于素数D转换的显微镜。由于激光功率可能沿光路衰减，因此在焦平面上对488 Nm和730 Nm激光的有效激光功率需要在开始转换实验之前，请使用功率计设备进行测量。
将胚胎转移到已经准备好（步骤A2）的玻璃底培养皿中的一滴用矿物油覆盖的KSOM中，并将其放在显微镜下。
在进行光电转换之前，先对绿色和红色通道进行z堆叠。
涂有底漆的转换将滤镜立方体插入光路，并通过放大到特定区域来转换选择的区域（这里是H2B标记的核）：同时使用488 Nm的光（30-50 Myu W ）和730 Nm的光（5- 10 毫瓦），〜20秒的转换时间和最大扫描速度（像素停留时间= 0.79 μ 小号）。
注意：根据荧光标记的强度，需要优化用于引发转换和转换时间的激光功率。有关更多详细信息，请参见本文档末尾的注释。

从光路中取出准备好的转换滤光片立方体，并检查实时模式下的转换效率。可以通过测量光转换前后红色和绿色通道中的荧光强度来计算转换效率，然后计算每个通道测试样品的红色和绿色通道中哪些光转换设置的折叠倍数最大，如有必要，请重复底涂转换（见图1）。
对绿色和红色通道的整个胚进行转换后的Z堆栈。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1902558--1417 Periklis PantazisPantazis 735593 \ Figs jpg \ Figure 1.jpg

1. H2B-图镨MEosFP标记胚胎前待发转换后有了不同的转换设置每个细胞核。A. 2细胞期胚胎光转化之前。B. 牛逼赫脎麽胚转换后用于730纳米的激光不同的权力： 5 毫瓦为低核，10 毫瓦为上nucleus.The转换时间为20秒两种nuclei.Scale栏= 100微米。

小鼠植入前胚胎的实时体积成像
在对小鼠胚胎的单个核进行有限的引发转化后，立即将10-1 5个胚胎转移到LS1光学显微镜系统的预先平衡的样品架中（步骤A3）。
将样品架放入LS1反向SPIM设置中在37 ° C和5％CO 2 的培养箱中。
在绿色和红色通道中，以规则的时间间隔（10-15分钟）为每个胚胎获取一个由8个0平面（相距3μm）组成的z堆栈，可以将胚胎成像到胚泡阶段。
注意：成像频率可以扩展到30-40分钟，而不会显着影响跟踪和谱系跟踪保真度。

数据分析

使用准备好的Track逐步进行分段，跟踪和沿袭跟踪

可以使用引发的Track分析在两个通道中获取的经过光转换的小鼠胚胎的延时3D图像，其中在Imaris （Bitplane ）中使用并实现了自定义的MATLAB代码。可以从以下代码存储库下载引发的Track的所有代码：

第一次细分

使用Imaris Spot检测工具检测胚胎中的绿色和红色细胞。使用较低的质量阈值来分割所有细胞，即使以包括虚假斑点为代价。选择适合所需细胞体积的斑点半径细分并启用“不同的光斑尺寸”。
在点检测算法的第四步中，选择一种质量，该质量允许在以后的发育阶段包括具有较低荧光信号的细胞。
在斑点检测算法的第六步中，选择区域阈值以根据斑点放置在其上的细胞表面的大小来设置斑点的大小。
设置一个滤镜以从分割中排除小的明亮背景斑点和微核（请参见图2），将创建一个新的斑点对象。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1902558--1417 Periklis PantazisPantazis 735593 \ Figs jpg \ figure 2.jpg

图2. H2B-pr-mEosFP标记的胚泡阶段处于胚泡阶段的胚胎，具有光转换（品红色）和未转换（绿色）细胞.A。分割前的原始图像B. 单个核（绿色和品红色斑点）的初始分割，然后过滤以进行筛选箭头大小表示假阳性背景斑点，可以使用斑点大小过滤器将其排除。

细分的首次微调

使用自定义MATLAB脚本从菜单中的分割中排除错误分割的斑点：图像处理> BSSE>斑点功能>验证胚胎中的细胞：

首先，选择包含所有（全局标记为绿色）单元格的点对象以及包含已转换（或部分标记为红色）单元格的点对象。
使用标记所有细胞的荧光通道（绿色表示光转换蛋白）估算胚胎的直径，将胚的半径粗略估算为所有最大点间距离的中值，选择一个可以补偿半径估算的乘性因子错误，并有可能防止胚胎外边界的细胞被错误地丢弃。
为了消除被错误地分割为两个斑点而不是一个单一斑点的斑点，请识别出现在用户定义距离同一通道中另一个斑点的距离内的斑点，将错误分割的双重斑点替换为一个新斑点（见图3）。
由于红色通道中的自发荧光高于绿色通道中的自发荧光，因此背景信号被分割为红色通道中的细胞的可能性更高，光转换后的红色细胞将始终保留一些绿色荧光，因此分段的红点应重叠删除所有与绿色斑点不重叠的错误分割的红色斑点（请参见图3）。
低绿色荧光信号可能导致分割检测失败，因此在上一步中也会错误地删除红点。作为补偿，如果先前的红色点存在，用户必须选择恢复这些红点。用户定义的搜索半径内的时间点。
将创建三个新的斑点对象：1）处理的斑点1 [ 包含所有单元格（绿色）] ，2）处理的斑点2 [ 仅部分标记的斑点（红色）] ，以及3）处理的斑点1-处理的斑点2（包含绿色不会与红色重叠的单元格。）将需要第三个斑点对象，以便以后进行谱系树的计算。
检查新的点分割是否令人满意，必要时调整分割滤镜设置。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1902558--1417 Periklis PantazisPantazis 735593 \ Figs jpg \ Figure 3.jpg

图3.分割错误示例。A . 一个核被错误地分割为2个斑点（白色）的Morula阶段胚胎。B 。红色通道中的自动荧光背景被错误地分割。图像分析算法将只允许您分割红色。与绿色斑点重叠的斑点可以克服背景信号的分割。

校正胚胎和作物的空间和旋转漂移

使用自定义的MATLAB脚本在Imaris菜单中的胚胎/标本的绿色和红色通道中注册细胞，方法是：图像处理> BSSE>参考框架功能>设置参考框架.MATLAB每次都用于创建Imaris参考框架对象将绿点的质心定义为原点，并通过矢量指定其方向。比较后续时间点之间的绿点的位置变化，并确定参考帧的旋转角度，以使细胞漂移最小化时间点之间的间隔。在Imaris中执行重采样。
选择促进胚胎中心点的斑点：选择已加工的绿色斑点。
选择斑点以估计胚胎的方向：选择已加工的红色斑点。
选择新创建的参考框架对象和“重新采样图像以使参考框架对齐”，选择“正确的图像和所有对象”，“旋转和平移”和“裁剪最大公共区域” 。
选择如何将数据裁剪为较小的卷。
使用Imaris菜单中的下一个功能重新对齐胚胎：图像处理> BSSE>参考框架功能>围绕参考框架轴正确旋转
选择促进胚胎中心点的斑点：选择已加工的绿色斑点。
选择新创建的参照系对象和“重新采样图像以使参照系对齐”，选择“正确的图像和所有对象”，“旋转和平移”和“裁剪最大的公共区域”。

细分的第二次微调

新注册的数据集可以包含，因为他们是用户定义的半径之外以前未分割红细胞（分割的第一细化和微调步骤2 ）.RE 经营;在注册胚胎分割的验证（分割的第一细化和微调小号TEP 小号1 - 7 ），回收红细胞以前未分段。
将创建三个新的斑点对象：1）重采样的斑点1 [ 包含所有单元格（绿色）] ，2）重采样的斑点2 [ 仅部分标记的斑点（红色）] ，和3）重采样的斑点1 –重采样的斑点2（包含绿色）不与红色重叠的单元格）。

追踪和血统树重建

使用Imaris的谱系模块随时间推移跟踪细胞并重建其谱系树。仅在绿色通道中为细胞创建单独的分段，而另一个包含光转换的红细胞的分段可通过以下方式降低谱系计算的复杂度：将其分解为两个更简单，计算量更少，不相关的对象集。
可选：手动更正沿袭树中的错误连接。

笔记

光转化蛋白的引发转化效率取决于细胞中存在的荧光信号的水平。因此，需要测试不同的引发转化参数，以便为您感兴趣的细胞定义最佳设置；即，细胞的强度激发光束和转换光束以及转换的持续时间。根据我们的经验，用于激发光束（488 nm）的激光强度对转换效率的影响最大，我们建议保持488 nm的激光强度尽可能低为了使漂白过程中荧光信号的损失最小化，仍需进行引发转换，这对于光转换之前显示低荧光强度的样品尤为重要。在我们手中，约20 s的转换持续时间可在对于有限的漂白效率，对于光转化蛋白表达水平高的样品，较长的为了获得更好的光转换效率，可能需要开启时间。

致谢

MW由荷兰研究委员会（NWO）的Rubicon博士后研究金和Peter und Traudl Engelhorn Stiftung的博士后研究金提供支持，PP获英国皇家学会颁发的Wolfson研究优异奖，该协议基于Welling 等人所做的工作等（2016）。

利益争夺

PP是ETH Zurich和Caltech提出的专利转换的专利申请的发明人（WO 2014/147211和EP 2014/055669）。PP 是HHMI和ETH Zurich提出的描述专利的专利申请的发明人mEosFP（申请序列号62 / 446,023）。

伦理

所有动物实验均由训练有素的人员按照我们机构的监管准则按照标准规程进行的。所有实验均获得瑞士巴塞尔州立州兽医当局的批准（许可证编号：2561）。

参考文献

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