材料和试剂

消毒玻璃瓶（派热克斯，康宁生命科学公司，目录号：1395-1L）或无菌塑料瓶，用于混合牛奶和柠檬酸钠（康宁，目录号：431533）
管50毫升猎鹰（任何产品，所述只要在无菌和无热原的，例如，康宁，目录数目：352070，费舍尔小号系统求解，目录号的：14-432-22）
1.7 ml卡口盖管（任何无菌且无热原的产品，例如，Corning，Costar via Sigma - Aldrich，目录号：CLS3620）
0.22 µm膜微过滤器（Corning，Sigma-Aldrich，目录号：CLS431224）
血清学吸管不同体积（只要无菌的和无热原的，任何产品例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：SIAL1485）
过滤1毫升枪头（任何产品只要无菌的，无热原和过滤，例如，热电科学，Ç atalog Ñ 棕土：94052410）
丁腈一次性手套（任何类型）
无菌湿巾/纱布（只要无菌单包装，例如，VWR，目录号：CA95041-740）
可选：EDTA 。可以作为即用型溶液（Sigma-Millipore，目录号：324506）购买，也可以从EDTA粉中自制
牛奶
在实验当天使用市售的牛奶或在“无菌条件”下收集和储存的原牛奶（使用无菌瓶尽可能无菌并保持瓶盖封闭直至进入生物罩）。多数为巴氏杀菌的商业超滤脱脂牛奶（Lactantia PureFilter ，在当地杂货店购买），因为它避免了可能导致差异的乳化步骤。我们建议使用三杯具有不同抢先日期的牛奶，牛奶必须在4 °C下储存。

注意：如果使用生奶，请使用不同奶牛的奶池以最大程度地减少个体差异。非商业生或巴氏灭菌的新鲜奶可以在-80 °C 下冷冻以避免细菌污染/扩散，但请注意，这样的储存可能会影响电动汽车的容量。牛奶，请确保事先进行脱脂和脱细胞处理，以最大程度减少因乳脂球或冷冻/融化循环而破坏细胞而引起的电动汽车形成。以小等份（50毫升）的速度冷冻牛奶，这样在融化时它会更快地达到熔点并限制电动汽车破坏。

布拉德福德氏试剂（Sigma-Aldrich，目录号：B6916）
BCA蛋白测定试剂盒（Millipore，目录号：71285-M）
Milli-Q水或任何过滤的超纯水（例如，Millipore，水系统清晰分选和过滤，目录号：ZRXQ003WW）
的NaCl（p 中内毒素referably低，例如，Millipore公司的西格玛，SAFC，目录号：1.16224）
KCl（例如Sigma-Aldrich，目录号：P3911）
Na 2 HPO 4 （例如Sigma-Aldrich，目录号：NIST2186II）
KH 2 PO 4 （例如Sigma-Aldrich，目录号：NIST200B）
HCl（例如Sigma-Aldrich，目录号：320331）
EDTA（例如Sigma-Aldrich，目录号：EDS-500G）
Milli-Q水中的NaOH溶液（例如Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
柠檬酸钠二水合物（Sigma-Aldrich，目录号：W302600）
磷酸盐缓冲溶液
可以购买市售的pH 7.4无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：P5493）或自制。

2％柠檬酸钠溶液（1 L）（请参阅食谱）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）10x（1 L）（请参阅食谱）
EDTA 0.5 M配方（100 ml）（请参阅食谱）

设备

与转子波纹管兼容的超速离心管（36 ml，Beckman，目录号：355631或344058或其他，请参见转子兼容性：https ://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LED/Specification-Sheets/Thermo-Scientific- SureSpin-630-（36 ml）-转子.pdf）
超速离心机SORVALL WX超速离心机（或一种热科学TM SORVALL TM WX 超速离心机，产品目录号：75000100，7500090，7500080）
转子SureSpin 630摆动铲斗转子（Thermo Scientific，目录号：79368）
注意：您可以使用其他离心机和其他转子，但要确保使用可比的材料。请注意，不建议使用定角转子，因为它们会导致更高的EV退化。

移液器（任何类型，例如通过Mandel的Drummond Scientific便携式Pipet-Aid XP，目录号：DRU-4-000-101）
轨道摇床（任何类型，例如，Bel- 艺术TM SP Scienceware TM Spindrive TM 轨道摇床平台，经由费舍尔科学，目录号：1451176）
旋转混合器/管式左轮手枪（任何类型，例如，热科学型，目录号：88881001）
高精密天平（任何类型，例如，赛多利斯，Ç atalog号：PRACTUM224-1S）
试管架不同尺寸（任何产品）
大号aminar流罩（如果工作在无菌条件）（任何产品）
微量，不同体积（任何类型的，只要它们是精确和移液是足够平滑，以避免液体悬浮液，过快喷出例如，移液器大号P1000L，100- 1000微升，金属喷射器，吉尔森，Ç atalog号：FA10006M）
-80°C冷冻室
磁力搅拌器

程序

注意：所有步骤均应在4 °C下进行。

开始超速离心并将装置温度设置为4 °C。
在无菌玻璃瓶或塑料瓶中混合125毫升脱脂牛奶和2％柠檬酸钠1：1。
注意：先倒入柠檬酸钠，然后倒入牛奶以加速酪蛋白胶束的破裂。

保持在摇15分钟，在4 ℃下。确保牛奶是轻轻mixi网纳克（1/4 个最大速度）。
注意：这可以在冷藏室中完成，也可以在摇杆上放冰，在冰上放牛奶。

15分钟后，应澄清牛奶（使其具有与血浆相当的半透明状态），并准备装入超速离心管中（图1）。

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图1.将脱脂牛奶与2％柠檬酸钠1：1混合后，在摇杆上于4 °C 孵育15分钟后，澄清牛奶

笔记：

添加碳酸钙会使澄清相反，从而证实该过程中钙螯合的参与。
如果您使用的牛奶没有澄清，您可以将柠檬酸钠的浓度增加到3 ％或4％。

用牛奶-柠檬酸钠混合物完全充满超透明离心管（图2）。
注：制作确保管被完全填充或者他们可能在离心打破。

将管放入转子管支架中，并使用无菌移液管通过在相对管之间转移牛奶-柠檬酸钠混合物来保持相对管之间的质量（图2）（保持管，柠檬奶溶液，管支架和盖的可比添加质量））。

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图2. Ultraclear 厚超速离心管应该被加载到管保持器的质量平衡为超速离心前

盖上盖子，将它们放在要使用的插座中（由管座和转子上的数字指示，图3）。

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图3.确保将SureSpin 管装入正确的插座中，以避免平衡问题

旋转电动汽车是理想的速度。在我们的协议中，我们在4 °C下以35,000 xg （35K）的速度分离了2小时的低速沉降电动汽车。我们使用了Sorvall WX TL-100超速离心机的K因子自动计算并将加速度设置为A = 9并在D = 9时中断。
注意：如果使用另一台超速离心机，请确保考虑到转子角度和k因子将g力的速度转换为适当的每分钟转数（RPM）。如果希望使用不同的速度，请参考转子和离心机制造商的建议（https ：//Assets.Thermofisher.Com/TFS-Assets/LED/Specification-Sheets/Thermo-Scientific-SureSpin-630-（36 Ml）-Rotor.Pdf。）如果使用生乳，则可以使用脱牛奶使液体脱细胞在4 °C下以1,000 xg离心10分钟，然后以4,500 xg离心30分钟，然后进行上述操作。

2小时后，电动汽车应已沉淀，在试管底部形成半透明的凝胶状沉淀（图4 C ）。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1903005--1382 Patrick Provost 837236 \ Figs jpg \图4.jpg

4.图35,000 Xg 超速离心后导致酪蛋白冻形成的未稀释和PBS稀释的牛奶。用柠檬酸钠稀释会导致EV含量高的小颗粒，酪蛋白污染极小。A. 从未处理的牛奶中分离出35,000 Xg的颗粒。B. 35000 X ģ 颗粒从稀奶1：1在PBS中。C. 35000 XG 颗粒从稀奶1：1在2 Pasento柠檬酸钠含有非常少的污染性酪蛋白。

注意：右边的小球包含P35K电动车，在丢弃印迹和悬浮液之前可能看不到，它固定在试管底部，因此在接下来的步骤中丢失的风险很小。

将克隆转移到新的干净/无菌超速离心管中。
注意：这可以使用血清移液器和移液器完成，也可以直接将上清液倒入新的试管中，具体取决于所需的无菌水平。

平衡上清液试管，并按照与前面相同的步骤在4 °C下以70,00 0 xg （70K）离心1 h 。
在70K超速离心过程中，将试管架上剩余的无液的含35K颗粒的试管放回，试管的底部带有无菌纱布/纸，试管的开口接触纱布/纸以使残留的液体被丢弃。纱布/纸内的毛细作用（图5）。

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图5. 纸管上的翻转管允许残留的液体因电容而被丢弃

注意：这是重要的，以避免污染与来自蛋白质印迹，并保持精确的悬浮液volumes.You可以使用移液管和提示，以丢弃在管内的任何剩余的液体或无菌纱布/纸。

将所有沉淀（6管）悬浮在相同的1 ml无菌过滤PBS溶液中。
笔记：

避免用尖头弄碎。使用移液器和1毫升过滤的尖头将PBS滴在其上，然后用PBS轻轻地从侧面开始“侵蚀”沉淀物，然后轻轻地到达中心。尝试快速有效地避免颗粒干燥，但避免粗略混合，否则最终会出现泡沫受限的颗粒悬浮液。
你也可以倒100 μ升PBS在管上，同时使用500您没有悬浮μ 升PBS暂停第一管。转移500 μ 升具有从而600第二管μ 升用于第二沉淀，等on.Depend你的应用，如果计划进行qPCR或进行功能研究，则可以在PBS中加入0.5％EDTA，以谨慎地进行悬浮。
将悬浮的P35K电动汽车转移到1.7 ml Eppendorf管中，并在4 °C 的旋转混合器中至少放置24 h，以使P35K电动汽车完全悬浮，然后将其在-80 °C 下保存几天。可能会导致一定程度的降解，因此在制备当天最好使用电动汽车。电动汽车还可以通过0.22 µm膜微滤器过滤，以确保其无菌性，并分解电动汽车聚集体，然后将其用于任何应用。
在进行P70K超速离心后，对P35K电动汽车进行以前的处理，将稳定剂转移到新的超速离心管中，并在4 °C的条件下对这些管进行100,000 xg 超离心（100K）至少1 h（时间越长，外泌体的产量就越高）达到）（图6）。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1903005--1382 Patrick Provost 837236 \ Figs jpg \图6.jpg

图6 。非稀释，PBS，稀释牛奶导致后70,000酪果冻的形成XG 超速离心。稀释柠檬酸钠导致小型EV-丰富的颗粒非常小酪蛋白污染。A. 70000 XG 颗粒从未经处理的牛奶。B. 70000 XG 颗粒从稀奶1：1.在PBS C. 70000 XG 颗粒从稀奶1：1在2 Pasento小号裂果柠檬酸盐。

注意：丢弃70K的小球或对其内容感兴趣的话将其保留（图6 C）。如果是这样，请像P35K电动汽车一样继续将其暂停。

P100K超速离心后，如果希望获得无EV的昆虫作为对照，请将100K电容器转移到新的超速离心管中，并在4 °C下进行100,000 x g 超速离心18 h 。
与以前的颗粒相同，将100K颗粒悬浮（图7 C），并以相同的方式存储EV。

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图7 。非稀释，PBS，稀释牛奶导致酪果冻后形成10万XG 超速离心。稀释柠檬酸钠导致小型EV-丰富的颗粒非常小酪蛋白污染。A. 100000 XG 颗粒从未经处理的牛奶。B. 100000 XG 颗粒从稀奶1：1.在PBS C. 100000 XG 颗粒从稀奶1：1在2 Pasento柠檬酸钠。

数据一nalysis

该协议不会生成数据，但会生成功能电动汽车，这些电动汽车的质量和内容可以通过不同的方法进行评估。

电动汽车浓度
可通过使用Bradford's试剂（Sigma-Aldrich）或BCA蛋白测定试剂盒（Millipore）评估其蛋白质含量，通过分离总RNA并确定其浓度（Nano D Rop ，生物分析仪，Qbit，Etc等）来间接定量最终颗粒的EVs含量。）或更精确地，通过使用高灵敏度的流式细胞术直接定量电动汽车（本穆萨等人，2017; Morales的-Kastresana和Jones，2017）或纳米粒子追踪分析（NTA）（加德纳。等人，2013年）。

电动汽车的特性和质量
如前所述（Benmoussa et al。，2017），可以使用光度法，动态光散射（DLS）和电子显微镜常规检查牛奶EVs特性。

电动汽车表征
我们在以前的出版物中提供了方法来分析牛奶EV的蛋白质（Benmoussa 等人，2019），小RNA （Benmoussa 等人，2019c），抗消化性和生物可及性（Benmoussa 等人，2016）以及生物活性（Benmoussa 等人，2016）。等，2019a）。这些方法包括EV密度分析，通过蛋白质印迹探索蛋白质含量，通过液相色谱串联质谱法进行蛋白质谱分析，通过RNA芯片或下一代测序进行小RNA和mRNA分析，TIM-1 体外消化。，双重萤光素酶测定法等。

EV功能活动
根据预期的结果，可能会采用不同的方法，我们会建议任何探索牛奶电动车领域的人阅读并遵循MISEV2018指南（Thery 等人，2018）。口头上，我们建议与MISEV2018一起探索与该协议相关的报告（Benmoussa et al。，2019a）。

笔记

通过该协议的设置，我们发现添加柠檬酸钠（以1％的最终浓度使用）可使牛乳透明，在外观和粘度方面可与血浆媲美，更重要的是，它防止了酪蛋白和牛奶的共分离。其他具有不同乳EV子集的乳蛋白（Famelart 等，1998; Kort，2012; Benmoussa 等，2017），这证实了钙在超速离心酪蛋白凝胶形成中的重要性。我们发现不同的EV柠檬酸钠引起的牛奶粘度变化使得牛奶中的一部分成为可能（Benmoussa et al。，2017）。这种粘度变化也可以解释我们在先前工作中分离出的牛奶电动汽车的相对纯度，因为它可能在所考虑的速度某些蛋白质或聚集的防止沉淀（本穆萨等人。，2016 ，2017 和2019b）。

重要的是，我们用2％的柠檬酸钠溶液以1：1的比例稀释了牛奶，而不是将柠檬酸盐晶体溶解在牛奶中，这将更大程度地改变牛奶的生物学特性（例如粘度），并可能阻碍某些特定食品的分离。电动汽车（Momen-Heravi et al。，2012）。

此外，在我们的手中，EDTA使用浓度足以螯合全部的钙在牛奶，并没有同样的效果在牛奶为柠檬酸钠，并且实际上导致酪蛋白沉淀（沃尔夫等人，2015年）。此外，我们在以前的作品，我们发现，酸化的乳或用EDTA预处理导致在电动汽车和外来体微小RNA含量的变化相比于全脂奶（本穆萨等人，2019c）.EDTA 可以从上面的，因为它可能不提供所讨论的其它螯合剂不同与酪蛋白连接形成可溶性酪蛋白酸钠的钠（de Kort 等，2009，2011 和2012; Kort 等，2012）。

该协议已在超过7个操纵器的手中使用了5年，显示出强大的可重复性，可与不同的牛乳（原料奶和市售巴氏杀菌奶）一起使用，并被认为可与不同种类的牛奶一起使用。

然而，值得注意的是，差异超速离心是一个漫长的过程，在某些条件下可能会对电动汽车的质量产生有害影响（Thery 等人，2018）。过滤步骤也可能会丢弃一些重要的电动汽车。每个人都应该表征全部内容牛奶电动车丢弃之前了Ing 潜在的重要群体，并比较电动车前和过滤后的效果。这也可能是重要的考虑其他途径来隔离乳电动车和哪个柠檬酸钠是兼容的。作为已知会破坏酪蛋白微胶束，胶束的大小大约是电动车（〜200 nm）的大小，柠檬酸钠可能提供了通过切向过滤或连续渗滤来分离牛奶电动车的方法（Phan 等人，2014； Busatto 等人，（2018），并通过消除排泄酪蛋白的需求来帮助使用体积排阻色谱法（Blans 等，2017）。甚至可以考虑从工业规模的体积中分离电动汽车使用模拟移动床尺寸-排阻色谱法以连续方式连续提取Es牛奶（Satzer Et Al。，2014）。还需要注意的是，柠檬酸钠的使用可能与其他方法或其他种类的牛奶不兼容验证应在此方法的任何长期/大规模实施之前进行。

在任何情况下，无论选择哪种方案，都强烈建议填写2018 MISEV指南清单并将其附加到所选方案上，以确保在牛奶电动汽车研究中具有可重复性和适当的报告（https://cdn.ymaws.com/www。 isev.org/resource/resmgr/misev2018_checklist.pdf）。

菜谱

2％柠檬酸钠溶液（1 L）
在通过0.22 µm膜微滤器过滤的1 L高压灭菌水中或高压灭菌的Milli-Q水中稀释20 g柠檬酸钠二水合物
使用磁力搅拌器搅拌10分钟
通过0.22 µm膜微滤器过滤
注意：您也可以准备10％柠檬酸钠的原液并根据需要稀释1/10，该溶液可在室温下保存数周，无需调节pH。

磷酸盐缓冲盐水（PBS）10x（1 L）
在800毫升Milli-Q水中

加入8克NaCl（p 中内毒素referably低，例如，Millipore公司-Σ，SAFC）
加入0.2克KCl
加入1.44克Na 2 HPO 4
加入0.24 g KH 2 PO 4
用HCl将pH调节至7.4
配以Milli-Q水，总体积为1 L
通过0.22 µm膜微滤器过滤溶液
注意：溶液可以高压灭菌以确保进一步无菌。

将10倍原液稀释至1倍，然后使用，将稀释的PBS通过0.22 µm膜微滤器过滤
注意：原液可在室温下保存，稀释后的溶液应在4 °C的无菌条件下保存，以免污染数周。

EDTA 0.5 M配方（100毫升）
在80毫升Milli-Q水中：

加入18.6克EDTA
使用磁力搅拌器搅拌10分钟
使用Milli-Q水溶液中的NaOH将pH调节至8.0
调整至100毫升
装满Milli-Q水至总体积为100 ml，并通过0.22 µm膜微滤器过滤
注意：溶液可以高压灭菌以确保进一步无菌，并在室温下保存数周。

致谢

这项工作得到了加拿大卫生研究所（CIHR）的资助，编号IG1-134171，MOP-137081（通过遗传学研究所）和PJT-165806（授予PP）.AB（编号262093）获得了博士学位作者希望感谢Patricia Savard在解决酪蛋白果冻形成方面的帮助，该协议以前曾在我们报道的作品中使用（Benmoussa 等人，2016、2017、2019a，2019b和2019c）。

利益争夺

作者声明没有利益冲突，并且，由于我们使用市售牛奶进行工作，因此作者无需获得伦理委员会的批准。

参考文献

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