材料和试剂

用料

细胞培养皿150 x 25 mm（Asi ，目录号：TD0150）
细胞培养皿90 x 20 mm（Asi ，目录号：TD0100）
5 ml血清移液器（Asi ，目录号：SP205）
10 ml血清移液管（Asi ，目录号：SP210）
细胞培养瓶75 cm 2 ，过滤帽（Asi ，目录号：TV0075）
细胞培养瓶25 cm 2 ，过滤帽（Asi ，目录号：TV0025）
注射器过滤，PES 25mm时，0.45 μ 米（阿西，目录号：TE45-5）
10 ml注射器（BD，货号：309604）
15 ml和50 ml锥形管（Denville，目录号：C1062-P）
18 G x 1½针（BD，货号：305196）
瓶顶过滤- 2 μ 米PES（VWR，CATAL OG号：97066-202）
15 ml离心管（CellPro ，目录号：CN5600）
50 ml离心管（CellPro ，目录号：CN5603）
过滤移液管尖端1250 微升（TRUpoint的，目录号：FT1250）
过滤移液管尖端200 微升（TRUpoint的，目录号：FT1200）
过滤移液管尖端20 微升（TRUpoint的，目录号：FT1020）
过滤移液管尖端10 微升（TRUpoint的，目录号：FT1010）
猎鹰FACS管35 μ MCELL 滤网（BD，目录号：352235）
猎鹰FACS收集管（BD，货号：352063）
冰桶
T4 DNA连接酶（新英格兰生物实验室，目录号：M0202S）
凝胶提取试剂盒（EZ，目录号：M1002-50）
一个铅球TM TOP10化学的COM 享有管辖权大肠杆菌（Invitrogen，目录号：C404003）
ZymoPURE TM II质粒Midiprep 试剂盒（Genesee Scientific，目录号：11-550B）
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒（50）（QIAGEN，目录号：27104）

细胞和质粒

人胚肾细胞（HEK 293T，克隆17）（ATCC ，目录号：CRL-11268）
质粒pQC -XIG （Addgene ，目录号：w497-1 ），由Eric Campeau博士保藏，他目前在加拿大卡尔加里的Zenith EpigeneticsLtd。
质粒pCMV -Delta R8.2 （Addgene ，目录号：12263 ），Didier Trono 博士保藏在EPFL
质粒pCMV -VSV-G （Addgene ，目录号：8454 ），由麻省理工学院的Robert Weinberg博士保藏
从Vector builder（https://en.vectorbuilder.com/）订购的gRNA自定义

试剂种类

高葡萄糖DMEM（1x）（Life Technologies，目录号：11995-065）
F-10介质（1x）（Life Technologies，目录号：11550-043）
0.25％胰蛋白酶-EDTA（1x）（生活技术，目录号：25200-072）
10％FBS（Hyclone ，目录号：SH30910.03）
聚乙烯转染试剂（Millipore，目录号：TR-1003-G）
抗生素-抗真菌药（100x）（生活技术，目录号：15240062）
聚乙烯亚胺（PEI）（Sigma-Aldrich，目录号：408727）
T4连接酶缓冲液（New England Biolabs公司，含有50mM的Tris-HCl，10 毫的MgCl 2 ，1 mM的ATP，10 毫DTT，pH 7.5）中
DMEM + F10培养基（45％DMEM + 45％F-10 + 10％FBS，含1x抗生素-抗真菌药）
核苷酸寡核苷酸/引物：

钽BLE 1. 在本协议中使用的引物列表

目的

名称

序列（5 ' -3 ' ）

报告者的靶序列

顶链靶寡核苷酸

ggccgcCATATGTGGGTGGGGGGAGTTTGCTCCAGGTGAAc

底链靶寡核苷酸

tcgagTTCACCTGGAGCAAACTCCCCCCACCCACATATGGcg

报道载体的测序引物

靶向CMV启动子的正向引物

AGAGCTCGTTTAGTGAACCGTC

反向引物靶向IRES

GACGGCAATATGGTGGAAAATAACATATAGACAAACGCACACCGG

靶向CMV启动子和克隆位点之间边界的正向引物

GAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACG

专门针对CFP的反向引物：

TAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCC

设备

5424 R离心机（Eppendorf，货号：540400138）
Labnet Accublock 数字干浴锅（Labnet ，目录号：19-41620）
Gene Mote涡旋混合器（Bioexpress ，目录号：S-3200-1）
CO 2 培养箱MCO-19AIC（UV）（Panasonic，目录号：13010002）
5702离心机（埃彭多夫（Eppendorf），目录号：022626205）
荧光显微镜
Aria-IIU流式细胞仪（BD）

软件

FCS Express 6（Denovo 软件– https://denovosoftware.com/）

程序

报告基因和gRNA构建体的生成
Frameshift（Fs）CFP- mCherryFP 报告基因的构建
由CFP，IRES和的核苷酸序列mCherryFP 和与侧接NotI位和EcoRV位的限制性位点是通过使用的服务合成金斯瑞，NJ。参见图1的图示中的矢量地图和所述核苷酸序列。
注意：由于CFP在5'端附近缺少内部起始密码子（ATG），因此被选为移码报告基因，这对于防止生成可能仍具有荧光性的较小蛋白质（例如在mCherryFP ）。尽管GFP在5'端附近也缺乏内部ATG，但它经常被用作许多包含基因组编辑机制的载体的标记。除了荧光蛋白外，在5'端附近没有内部ATG且可以被特异性检测或选择的蛋白也可以设计为移码报告基因。这些可以包括荧光素酶，β-半乳糖苷酶或氨基糖苷3'-磷酸转移酶。

图1。报告质粒的构建。在（A）中，存在pQC- FSCFP- mCherryFP 的载体图的示意图，其由pQC- XIG载体（来自Addgene ）修饰，具有如图（B）所示的合成核苷酸序列。将合成的序列（5 ' -链示出）将被克隆到PQC 通过限制性位点-XIG矢量的NotI 和EcoRV位。该克隆将取代原始的IRES和GFP区域。它还将介绍CFP编码序列和其他克隆位点。在此处展示的示例中，它还包括20 nt 靶序列。

上述- 描述的核苷酸序列被克隆到一个模板矢量，PQC -XIG，使用限制位点的NotI 和EcoRV位（5分别'端和3'端）。
注意：为了在以后的克隆中引入多个位于CFP和mCherryFP 序列两侧的克隆位点，这替代了pQC -XIG载体中的原始IRES和GFP序列。

用Not1和Xho1（分别为5'端和3'端）消化从上方生成的FsCFP-mCherryFP 报告质粒。凝胶使用凝胶提取试剂盒（EZ）纯化消化的载体，并将产物存储在-20 ℃。
注意：不要期间或消化后进行磷酸酶处理，除非定制订购寡聚物3 ' 磷酸化的。

在FsCFP-mCherryFP 报告基因中引入靶序列（引物/寡核苷酸的核苷酸序列也请参见表1）
合成靶序列- 例如，在人类对VEGF-A基因的靶序列为5' - GGGTGGGGGGAGTTTGCTCC - 3'。靶向序列位于START密码子之后，然后是原间隔子相邻基序（PAM）位点和过早的STOP密码子。如有必要，可以添加几个（1-5）额外的核苷酸，以确保CFP不符合标准。在所示的示例中，包含未成熟的STOP密码子是为了防止由于CFP的移码编码序列而产生长蛋白，这可能对细胞有害（图2）。然后，使用Genscript 服务合成包含上述（目标）序列以及NotI （5'）和XhoI （3'）消化产生的突出核苷酸的核苷酸寡核苷酸（5'和3'链）。新泽西州：
上链目标寡核苷酸：5'-ggccgcCATATGTGGGTGGGGGGAGTTTGCTCCAGGTGAAc-3'

底部链目标寡核苷酸：5'-tcgagTTCACCTGGAGCAAACTCCCCCCACCCACATATGGcg-3'

注意：如果退火，则两个寡核苷酸代表NotI （5'）和XhoI （3 ' ）的双消化产物。（图3）

图2示意图中的核苷酸序列侧翼的目标插入区。20核苷酸（位置NT ）gRNA匹配站点，Cas9结合3NT-protospacer相邻基序（PAM）序列是在与START和STOP密码子沿dicated。的总重量○在该特定示例中额外的核苷酸被包括，以确保出框外的CFP。包括过早的STOP密码子，以防止CFP编码序列移位帧上的START密码子翻译出长产物。

图3的5退火' -链和3 ' -链寡核苷酸。在含有从例如人VEGF基因的寡核苷酸序列与20-nt的靶序列（粗体红色字体），起始密码子，PAM站点，提前终止密码子，以及突出核苷酸，这将导致从NotI位（5'）和XhoI （3'）消化（以小写字母显示）。退火后，5 ' 和3 ' 链一起代表Not1和Xho1的消化产物。

退火- 在Eppendorf管中，在1从上方（步骤A2A）混合两种寡核苷酸：1倍的比例至20的最终浓度μ 中号（各）在1×T4连接酶缓冲液。将试管放在沸水（100°C）中10-20分钟，然后让水在室温下冷却8-12小时，以进行退火处理。该产品可以新鲜使用，也可以在-20°C下保存。
连接– 将退火的寡核苷酸与步骤A1c中消化的载体混合。与分子中的载体相比，该寡核苷酸将过量3-10倍（建议5倍）。在1x T4连接酶缓冲液（NEB）存在下，通过添加T4 DNA连接酶（NEB）进行连接。对于每个20 μ 升通常含有1反应μ 克消化的载体和0.05的μ 克退火的寡核苷酸，1 μ 升溶液中加入连接酶。连接反应在16°C下进行2小时，然后在8°C下过夜
细菌转化-连接后从上述制品被引入到TOP10细胞（Invitrogen）中，根据制造商“ 小号指令。一般情况下，2〜3 μ 升连接产物的用于转化50 μ 升细菌。将转化的细菌铺板于LB到+氨苄青霉素（50 μ 克/毫升）在37℃下过夜平板孵育。生长的菌落从平板上挑取在5毫升（50生长液体LB +氨苄青霉素μ 克/毫升）过夜。然后质粒使用分离Qiagen公司的QIAprep 旋转小量制备试剂盒，然后提交Sanger测序用引物特异性地靶向CMV启动子，CFP区域（不与交叉反应mCherryFP 区域），和质粒的IRES区（图URE 1 甲）。
表1列出了该协议中使用的引物。

靶向CMV启动子的正向引物：

5 ' -AGAGCTCGTTTAGTGAACCGTC-3 '

靶向IRES的反向引物：

5 ' - GACGGCAATATGGTGGAAAATAACATATAGACAAACGCACACCGG-3 '

靶向CMV启动子和克隆位点之间边界的正向引物：

5 ' -GAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACG-3 '

专门针对CFP的反向引物：

5 ' -TAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCC-3 '

携带含有在预期的插入序列的质粒的集落FsCFP-mCherryFP 记者然后在100ml生长液体LB +氨苄青霉素（50 μ 克/毫升）过夜。然后用Midiprep 试剂盒（ZymoPURE TM II质粒Midiprep 试剂盒）分离质粒。该产品可在20°C下保存。
指导RNA（gRNA）的构建
可以使用GFP作为选择标记，从Vector Builder INC（https://en.vectorbuilder.com/）设计和购买gRNA和Cas9的质粒。例如，VEGF的gRNA序列将为–GGGTGGGGGGAGAGTTTGCTCC。作为对照，也应订购加扰的gRNA。

用FsCFP-mCherryFP 报告基因和gRNA 创建细胞系
用报告基因和gRNA制备细胞系的过程分为两步。

步骤B1：感兴趣+细胞系FsCFP-mCherryF P （报道质粒）→ 排序为的mCherry 阳性细胞

步骤B2：用细胞系FsCFP-mCherryFP +（目标）gRNA-GFP → 排序为mCherry的和GFP双阳性细胞。

步骤B1：用FsCFP-mCherryFP 报告基因生成细胞系

HEK 293T细胞系中慢病毒颗粒的产生
首先，播种HEK 293T细胞，使其在T-25培养瓶中达到约75％的融合度，这可以通过显微镜观察来估计。在以下转染步骤之前更改DMEM + F10培养物。

在1.5ml Eppendorf管（管1），加入1 μ 克VSV-G，6 μ 克德尔塔R8.2的，和6.5 μ 克含有靶向序列（来自步骤A2E）报告质粒至0.5 毫升的DMEM + F10媒体。在微型旋转器或普通台式离心机中以2000 xg的速度涡旋20-30 s混合并短暂旋转（少于10 s）。
0.5毫升DMEM添加到另一Eppendorf管（管2），再加入30 μ 升活化的聚乙烯亚胺试剂（Sigma）或其它类型的转染试剂如脂质体（热-费希尔）或JetPrime （Polyplus -Transfection）。立即涡旋30 s。如上简要旋转组件。将试管1中的内容物加入试管2。立即使试管涡旋20到30秒，然后再次短暂旋转。在室温（RT）下孵育20-30分钟。
孵育后，将转染混合物逐滴添加至装有HEK 293T细胞和新鲜培养基的烧瓶中。轻轻混合，然后将烧瓶置于37°C，5％CO 2的培养箱中，以在接下来的三天内产生病毒颗粒。这些细胞中的大多数（> 50％）有望在24小时后表达mCherryFP （激发587nm，发射610nm），这可以通过在荧光显微镜下红色荧光的存在来目视验证。
24小时，48小时和72小时后（如有必要）从产生病毒的HEK 293T细胞中收获培养基。用新鲜的培养基代替。
将收获的培养基放入无菌的50 ml锥形管中。加入聚凝胺至30的最终浓度μ 克/毫升。短暂涡旋混合。
[可选]以1,000 xg 的旋转桶转子旋转2分钟，以除去细胞碎片。
使用注射器和0.45微米注射器过滤器过滤上清液。上清液应立即用于靶细胞，尽管也可以在4°C下保存三天。如果需要更长的存储时间，则应将上清液等份分配并在液氮中速冻，然后在-80°C下存储。
靶细胞转导
作为说明，将HEK293T细胞用作靶细胞，以接受从上方产生的慢病毒（步骤B，步骤B1-1）。

在T-75烧瓶中培养HEK 293T细胞。如在光学显微镜下目测估计，在第一次病毒转导之前，细胞的密度应低于30％融合。
稀释含有病毒的上清液收获版用2x体积的新鲜培养基的从T-25细胞中的步骤B1-1。用含有病毒和聚凝胺（最终浓度10该混合物代替在T-75烧瓶中含有靶细胞的培养基μ 克/毫升）中。
第二天再重复一次以上步骤。
在荧光显微镜下检查mCherryFP 荧光，以确保荧光阳性细胞少于20％，以避免过度感染。
注意：重要的是在病毒诱导阶段的任何时候，使靶细胞的融合度保持在75％以下。

携带报告质粒的靶细胞分选
胰蛋白酶化，并通过与新鲜培养基（使用的胰蛋白酶溶液中的至少5体积）冲洗收集靶细胞。将混合物转移到无菌的50 ml锥形管中。通过在室温下以1,500 xg的离心斗转子离心3分钟来收集细胞。
注意：将未分类的细胞在-80°C下冷冻，以创建备份。

将细胞重悬于1 ml分选培养基（DMEM + 抗生素-抗真菌剂）中，该分选培养基应产生约1000万个细胞/ ml的密度。
使细胞通过带有35微米细胞过滤器的FACS管。
在FACS收集管中加入1 ml分选培养基。
使用没有任何mCherry 质粒的靶细胞作为流式细胞术中门控目的的阴性对照。
使用FACS-BD Aria-Ilu流式细胞仪对细胞进行mCherry 阳性分选。
注意：为了成功进行后续培养，我们建议每个样品至少采集20,000个细胞。

培养的mCherry 阳性细胞在T-25烧瓶中，用5 米升新鲜的培养基。将培养物扩大到更大的烧瓶（例如T-75）中，以生成携带报告基因的细胞用于下一步，并将等分试样保存在-80°C下。
注意：应定期检查表达报告基因的细胞的质量，这可以通过在荧光显微镜下至少90％的细胞中存在红色荧光来验证。

步骤B2：产生共表达FsCFP-mCherryFP 和gRNA-GFP 的细胞系

HEK 293T 细胞系中慢病毒颗粒的包装
除了将gRNA-GFP质粒（VEGF-gRNA-GFP或加扰序列gRNA-GFP）与这些质粒VSV-G（编码病毒）一起使用外，此步骤与上述步骤（步骤B1）相似。包被蛋白）和DeltaR8.2（编码逆转录酶HIV1-pol和包装因子HIV1-gag适用于慢病毒）。

用含gRNA-GFP的慢病毒转导表达报告质粒的靶细胞。
在继续操作之前，请在荧光显微镜下对表达报告质粒的靶细胞进行快速视觉验证，以确保90％以上的细胞为mCherry 阳性。

注意：在第一次病毒诱导（24小时）之前，在T-25烧瓶中生长的靶细胞（表达报告质粒）应汇合约30％。

靶细胞可以被重复诱导2-3天。在诱导结束时，产生GFP的细胞应少于种群的50％，以避免过度诱导。

携带报告基因和gRNA的靶细胞的分选
72小时后，在荧光显微镜下检查靶细胞的转染效率，以确定是否存在mCherry 和GFP荧光。

注意：将未分类的细胞在-80°C下冷冻，以创建备份。

如上所述处理细胞以进行分类（步骤s B3a- B 3d）
排序时，使用适当的阳性对照进行门控。细胞不表达任何荧光蛋白，或仅表达GFP，仅mCherryFP 或表达GFP 加mCherryFP的细胞应用作阴性对照，以检测CFP阳性事件的门。通常，检测阈值可以设置为高于阴性对照产生的最大信号的两倍。如有必要，表达功能性GFP，mCherryFP 和CFP的细胞也可以用作阳性对照（尽管通常不是必需的）。
为双阳性细胞至少采集100,000个事件，以确保可靠检测任何三阳性细胞。
使用FACS-BD Aria-Ilu流式细胞仪对mCherry 和GFP双阳性以及任何mCherryFP ，GFP和CFP三阳性人群的靶细胞进行排序。应调整CFP阳性事件的分类门设置，以使收集窗口比三个阴性对照中任何一个的CFP通道的主要种群边缘至少高2倍。相反，所收集的双阳性细胞不应包含高于阴性对照的CFP信号。
生长并扩展双阳性和三阳性细胞以进行进一步分析。
注意：将分类的细胞冷冻在-80°C下，以创建备份。

FACS数据分析
通过使用FCS Express 6或FlowJo 分析FACS数据。CFP阳性细胞的双重之间的百分比- 阳性细胞可以使用FCS Express 6中和MS-Excel中量化。
前向和侧面散射应用于排除细胞碎片/碎片或细胞团块/团块。GFP和mCherryFP 信号的检测阈值应通过未处理的亲代细胞或用仅GFP或仅mCherryFP的表达载体稳定转导的亲代细胞建立。为双选通阈值- 阳性细胞（GFP和mCherryFP ）应当被至少一个从各个阳性（GFP-只和折叠起来的mCherry -only）（图4）。

图4 。示意图显示流式细胞术门控策略。通过使用前向散射和侧面散射将门控应用于单个细胞和活细胞。对于单个荧光（GFP和mCherry ），基于阴性对照，仅GFP对照和仅mCherry 对照应用门控。选择GFP和mCherryFP 双阳性细胞的门应至少比仅GFP和mCherryFP 细胞的信号的上边缘高出一倍。

在采样组中对GFP和mCh erryFP 双阳性细胞应用门控，然后在该群体中寻找CFP阳性细胞。CFP的门控应使用表达GFP加mCherryFP 但不表达CFP的CFP阴性对照细胞建立。根据我们的经验，也可以使用携带报告基因（带有mCherryFP 标记）和pQC -XIG（带有GF P标记）的细胞来设置此阈值。选通应设置为至少比CFP阴性细胞生成的CFP信号主要种群的边界高两倍。
同一组门控应普遍应用于所有样品组。CFP荧光的存在指示in / del事件的发生，从而成功进行了基因组编辑（请参见图5中的示例）。非特异性（ns）加扰序列gRNA-GFP（图5）反映了通过非特异性基因编辑自发产生的CFP事件的背景信号。

图5 。使用此报告工具在HEK293T细胞中描述CFP阳性事件的数据示例。数据显示没有CFP荧光（FsCFP- 具有来自人VEGF基因+ pQC -XIG的靶序列的报告子）；自发诱变引起的背景CFP荧光（报告基因+ 非特异性（ns）gRNA）；in / del事件（报告+ VEGF gRNA）发生了CFP阳性事件。GFP + MCH +表示双重的选通- 阳性细胞（GFP和mCherry的）。GFP + MCH + CFP +表示CFP +阳性事件在第存在E双击- 阳性细胞（GFP和mCherry的）。

可以使用MS-Excel或软件的内置功能（在这种情况下为FCS Express 6）来计算每个细胞群体中双阳性中CFP事件的数量或百分比，即基因组编辑效率的读数。）。
基因组序列细胞集落分析
如果需要，单- 细胞集落可通过稀释来生产和在DNA分析96孔板分选的细胞的扩散。有关测试中所有步骤的摘要，请参见图6。

图6.图表示工作流和估计时间来建立携带的细胞系FsCFP-mCherryFP 记者和执行的基因组编辑测定（与Cas9作为一个例子）

笔记：

如果靶序列含有内部的START密码子，则应注意确保其不会导致CFP的框内翻译。如果是这种情况，可以在PAM位点之后（最好在过早的STOP密码子之后）插入一个额外的核苷酸，以进一步移动阅读框。
该方法对低频输入/删除事件也很敏感。我们已经通过突变靶向gRNA中的两个中心核苷酸来测试了这一点，这有望显着降低靶向效率。当这种突变的gRNA与报告基因共同表达时，在表达GFP和mCherryFP 的细胞中检测到CFP信号大大降低但仍具有统计学意义。
自发诱变，例如碱基切除引起的诱变，也可能导致CFP信号的重新激活。但是，根据我们的经验，这种自发事件的大小（如报告基因和pQC -XIG载体所证实的细胞）比补充有非特异性gRNA的Cas9的非特异性作用低至少一个数量级。因此，根据我们的经验，使用携带报告基因（带有mCherryFP 标记）和pQC -XIG载体（带有GFP标记）的细胞来建立CFP检测门是安全的。但是，如果需要较低的背景来设置CFP检测门，则可以将仅表达GFP和mCherryFP 且不携带任何CFP编码序列的细胞用作对照。
为CFP检测栅极可以或者上下移动几个（1-5）折叠，只要阈值在CFP-阴性对照细胞的主要群体的边界（与GFP和上述mCherryFP 双- 阳性）和只要将通用门应用于所有采样组，每个组之间的差异仍将存在。

致谢

我们感谢Sylvester综合癌症中心的流式细胞仪核心设施提供的服务。我们还要感谢资金资源– NIGMS / NIH，R01＃GM107333；国防部（CDMRP），创意奖，PC140622。这些资助资源部分支持作者的薪水和实验费用。这些资助机构没有直接参与研究设计，收集，分析，数据解释或手稿撰写的任何部分。该协议改编自已发表的工作（Kumar 等人，2019）。

利益争夺

作者宣称他们没有竞争的财务利益。

参考文献

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