材料和试剂

0.2 µm 过滤器（Corning）（Sigma-Aldrich ，目录号：CLS431229）
无水磷酸氢二钾（Sigma-Aldrich ，目录号：795496）
磷酸钾一元，无水（Sigma-Aldrich公司，目录号：795488）
黄嘌呤（Sig ma-Aldrich ，目录号：X7375）
黄嘌呤氧化酶，冻干POW d ER（Sigma-Aldrich公司，目录号：X4376）
大肠杆菌SdhA
如Maklashina 等人（2018年）所述，用N末端融合的His-tag分离大肠杆菌SdhA 。

葡萄糖（Sigma-Aldrich ，目录号：G8270）
过氧化氢酶（Sigma-Aldrich ，目录号：C30）
葡萄糖氧化酶（Sigma-Aldrich ，目录号：G2133）
靛蓝四磺酸钾（ITS）（Sigma-Aldrich ，目录号：340596）
苄基紫精（Sigma-Aldrich ，目录号：271845）或甲基紫精（Sigma-Aldrich ，目录号：856177）
黄素蛋白，分离的SdhA （参见表达和纯化方法; Maklashina 等人，2018）
超高纯5.0级氩气（Airgas ，货号：AR UHP300）或超高纯5.0级氮气（Airgas ，货号：NI UHP300）
连二亚硫酸钠（Sigma-Aldrich ，目录号：71699）
Apiezon L型高真空润滑脂（Fisher Scientific ，目录号：50-365-186）
氮气/氩气
甲苯蓝
甲基硫酸吩嗪
硫氨酸
亚甲蓝
花青素
靛蓝四磺酸盐
试卤灵
靛果磺酸
靛二磺酸盐
2-羟基-1,4萘醌
甲酚紫
2,6-二磺酸蒽醌
蒽醌-2-磺酸盐
酚红素
番红花T
50 mM磷酸钾，pH 7.0（请参阅食谱）
黄嘌呤溶液，10 mM（请参阅食谱）
黄嘌呤氧化酶溶液（请参阅食谱）
葡萄糖溶液，1 M（请参阅食谱）
过氧化氢酶溶液（请参见食谱）
葡萄糖氧化酶溶液（请参阅食谱）
参考染料溶液（请参阅配方）
苄基紫精或甲基紫精（请参阅食谱）

设备

分光光度计（例如，Agilent 8453紫外可见分光光度计，能够在300 至800 nm 之间扫描，光谱分辨率为1 nm）
温度控制由安捷伦的Peltier装置提供。任何手段以保持恒定的温度是合适的（即，ç uvette保持器，其中所述温度由一控制水浴，例如）。

适当的比色杯在严格的厌氧条件下进行反应（图2）
反应之前的注意事项：

选择一个厌氧比色皿。该方法依赖于反应持续时间所需的严格厌氧条件。一些实验室可以很好地进行此类研究，并在厌氧罩中放置一个分光光度计。但是，对于许多实验室而言，此选项可能不可用，因此应使用专用的光学比色杯将反应与有氧环境良好隔离（图2）。经典的厌氧比色皿（图2A）具有一个侧臂，并且通过反复施加真空并用氮气/氩气代替空气的循环来交换空气。将用于引发反应的黄嘌呤氧化酶（XO）放在侧臂中，并在将比色皿关闭后用真空油脂密封后混入反应中。替代地，如果在图2A所示的专门反应杯不可用，一个标准的塞子塞住试管（图2B）可以被使用。通过气密性注射器穿过不透氧气的隔膜进行添加（图2B，顶部）。我们和其他人使用的最方便的方法是使用普通的带塞比色皿（图2B，底部）。为了达到测定所需的厌氧条件，我们使用了可以有效消除溶解氧的葡萄糖/葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶除氧系统。另外，用低流量的氩气/氮气冲洗比色皿的顶部空间。为了引发反应，用气密注射器添加XO，注射后将反应物小心地与注射器针头混合。对于某些测定，当使用极低电位的黄素蛋白或染料（即，电位低于-300 mV）时，应通过氧气洗涤系统另外处理氩气或氮气，以除去痕量的氧气。使用气密比色皿（图2A）也将是有益的。反应的最终体积通常为1 ml，但可以根据比色皿类型和要研究的蛋白质量按比例放大或缩小。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902880 Gary Cecchini 636980 \ Figs jpg \图2.jpg

图2.可用于厌氧测量的光学比色皿。一。带有侧臂的密封厌氧比色皿。B.带有隔垫的试管（顶部）和配有硅胶塞的标准光学试管（底部）。两个比色皿均可与气体管线一起使用，以供应氩气/氮气（显示在底部比色皿中）。

选择合适的染料。通常，参考染料的E m 应在目标蛋白的预期黄素电位上±30 mV以内。表1总结了一些用于测定黄素还原电位的参考染料。选择染料的一些技巧：对于具有已知潜力的黄素蛋白突变体，应从E m 最接近野生型的染料开始。例如，突变可导致黄素对蛋白质的附着改变。共价结合的黄素比非共价的黄素具有更高的还原潜力（Heuts等。，2009）。由于野生型SdhA 的黄素电位约为-50 mV ，因此我们使用的染料（ITS）的氧化还原电位接近此值（请参见表1）。

表1.参考染料

染料

E m （mV ）

甲苯蓝

+115

甲基硫酸吩嗪

+80

硫氨酸

+64

亚甲蓝

+11

花青素

-34

靛蓝四磺酸盐

-46

试卤灵

-79

靛果磺酸

-81

靛二磺酸盐

-125

2-羟基-1,4萘醌

-1 42

甲酚紫

-166

2,6-二磺酸蒽醌

-184

蒽醌-2-磺酸盐

-225

酚红素

-252

番红花T

-289

苄基紫精*

-359

甲基紫精*

-446

*紫罗兰是一种单电子还原染料，所有其他均经过两电子还原。

选择波长以监测黄素和染料的吸光度变化。如该图所示URES 1 一个ND 4，黄素和染料的氧化和还原形式从含有两个成分的频谱进行计算。因此，用于分析的波长应表示光谱变化仅归因于一种成分，而第二种成分引起的吸光度变化可忽略不计。例如，SdhA 中FAD的最大吸光度约为460 nm，但是，ITS的还原形式也在该波长下吸收，并且会干扰FAD浓度的正确确定。然而，连二亚硫酸盐还原的ITS的单独光谱显示485 nm是ITS的等压点（如图3所示）。FAD在485 nm处也保留了显着的吸光度，因此该波长可用于计算FAD的还原/氧化形式，而ITS没有任何贡献。[R 的排出ITS在614纳米，峰值吸收，那里是F无干扰测量ROM 黄素吸收。因此，黄素的485 nm和染料的614 nm的波长可用于分析。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902880 Gary Cecchini 636980 \ Figs jpg \图3.jpg

图3. ITS 的等量点。氧化的ITS的光谱显示为实线，连二亚硫酸盐还原的ITS 显示为虚线。这两种形式显示以485nm，同样的吸光度即，在等吸收点。

气密注射器，用于厌氧分析

软件

Microsoft Excel或任何其他电子表格程序以进行数据分析

程序

对于该测定，我们使用了图2B（底部）所示的常规光学比色杯和氩气。在比色杯中，添加50 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0，25°C）和指示最终浓度的试剂：10 mM葡萄糖，5 µg / ml过氧化氢酶，0.3 mM黄嘌呤，50 µg / ml葡萄糖氧化酶和苄基紫精（ 10-20 µM）。低流量的氩气/氮气层积在比色皿的顶部（不鼓泡）。记录基线光谱。
加入足够的黄素蛋白（SDHA ）在450-460纳米，这对应于100，得到0.1-0.5的吸光度ONDS 到8-40μMFAD（仔细混合）。在〜460 nm的FAD和染料（614 nm的ITS）之间，最大吸光度应相似。频谱350之间扫描和750纳米，和记录。该光谱对应于黄素蛋白和染料的氧化态。
等待约15分钟以建立厌氧条件，然后在气密注射器中添加黄嘌呤氧化酶（通常范围为10-50 nM ）。应调节黄嘌呤氧化酶的浓度，以使电子转移足够缓慢，以使整个系统始终保持平衡。设置分光光度计以1-3分钟的间隔记录光谱。试剂的浓度应使黄素和染料在1-4小时内完全还原。
如光谱显示没有进一步变化或苄基紫精开始减少，反应就停止了，如550-600 nm区域吸光度的增加所示。
最后，从分光光度计传输单个光谱（波长与吸光度），并将其合并到Excel电子表格中。图4展示了使用ITS 还原SdhA 的单个实验的光谱组。

D：\ Reformatting \ 2020-2-7 \ 1902880 Gary Cecchini 636980 \ Figs jpg \图4.jpg

图4. 在黄嘌呤/黄嘌呤氧化物存在下，SdhA 和ITS 厌氧还原过程中观察到的光学变化。A. ģ 拍摄和组合个别光谱。B. Excel电子表格的一个示例，该示例结合了在测量过程中获得的5 倍采样率。

故障排除

黄素和染料不完全还原（或缺乏还原）的主要原因是氧气泄漏和/或黄嘌呤氧化酶活性低。建议的检查厌氧条件的测试，即XO还原苄基紫精的方法是从测定中省略黄素蛋白和染料。在厌氧条件下应观察到BV的降低（E m = -359 mV）。BV的氧化形式是无色的，当BV开始还原时，在550-600 nm处形成一个宽峰。
如果黄素或染料的几乎完全还原先于第二配偶体的还原，则黄素和染料之间还原电位的差异已超过该方法的要求，应选择不同的染料。具有较高电势的组分将首先被还原，这将有助于确定下一个要尝试的染料的还原电势。

数据分析

蛋白质和染料的E m 电位差是从图中计算得出的，其中将蛋白质和每种光谱对应的染料的氧化/还原形式之比相互绘制在一起。

对于此计算，将数据拟合到能斯特图。逐步推导来自（Efimov 等，2014）。

含有黄素的蛋白质（P）和染料（D）的还原电位通过使用能斯特方程确定：

XO缓慢的电子输入速率可确保在任何给定时间点蛋白质和染料的氧化形式和还原形式的平衡。因此，它们的电化学势也相等：

将x 定义为蛋白质的能斯特浓度项，将y 定义为染料的能斯特浓度项。

当蛋白质处于氧化还原平衡时[ P ox ] = [ P red ]，x = 0；y定义为ΔE，即蛋白质和染料的中点电势之差。

为了确定ΔE ，从每个光谱计算染料（y）的能斯特浓度项和蛋白质（x ）的能斯特浓度项并相互作图。蛋白质和染料的[氧化] / [还原]浓度之比是使用为每种组分指定的波长确定的。在我们的实验中，我们将d 4 85 nm用于FAD，将614 nm用于ITS。

w 在此，A max 是氧化形式的吸光度，A min 是还原形式的吸光度，A是从每个光谱获得的吸光度。现在使用热力学常数RT / nF 等于12.5。（R =气体常数；T = 开氏温度，F = 法拉第常数；n = FAD和ITS还原的电子数，FAD和ITS 均为n = 2）并获得了x 和y 的最终方程。

下面，我们使用来自组光谱（数据图5 ）来计算È 米FAD 在SDHA 。

计算方式

我们从氧化光谱和反应结束时的光谱中确定蛋白质FAD（列B）和染料（列D）（图4）的A max 和A min 。
接下来，使用每个光谱中选定波长（B和D列）的吸光度，计算蛋白质FAD（C列）和染料（E列）的能斯特浓度项（图5A）。y vs的图形表示。x给出一条斜率为1的直线，其截距等于y或ΔE，即蛋白质FAD和染料之间的中点电势偏移（图5B）。因此，ê 米FAD 在SDHA 为-55 0.5 毫伏。该值类似于通过校正用于分析的不同pH值后通过电位滴定确定的四亚基琥珀酸脱氢酶复合物的E m FAD （Cheng 等人，2015）。由于FAD在SdhA中共价连接，因此中点电位明显高于游离黄素的E m FAD （-219 mV）。

图5. 最终计算。A. Excel电子表格的示例，其中包含SdhA和ITS的能斯特浓度项的计算。B.对应的能斯特图。

笔记：

经常观察到，曲线远端的点未对齐。这对应于反应的状态，在该状态下，蛋白质和染料主要以其氧化和还原形式存在，而平衡所需的时间比XO反应的速度要长。因此，在实验点形成斜率等于1 的直线之前，通常会从图中省略这些点。
该实验证明了Ë 米的2e的判定- 还原FAD的/ FADH 2 中SDHA 。在一些黄素蛋白1E - 还原FAD可以产生稳定的半醌自由基FAD 可以观察到的作为还原成氢醌之前的中间形式。

菜谱

50 mM磷酸钠（pH 7.0 ）
溶解4.67 g K 2 HPO 4 （磷酸氢二钾）和3.15 g KH 2 PO 4 （磷酸氢二钾），并用蒸馏水将最终体积调至1升

黄嘌呤溶液，10 mM
将15.2 mg的黄嘌呤溶于9.9 ml的蒸馏水和0.1 ml的1 M氢氧化钠中（储存在-20°C）

黄嘌呤氧化酶溶液
在50 mM磷酸钾pH 7.0中为0.2 mM （储存在-20 °C ）

葡萄糖溶液，1 M
1 M蒸馏水制成

对于较长的存储，过滤器使用0.2μ除菌米过滤器（Corning）中（储存于-20 ℃下）

过氧化氢酶溶液
50 mM磷酸钾pH 7.0中的过氧化氢酶（5 mg / ml）（储存在-20 °C ）

葡萄糖氧化酶溶液
50 mM磷酸钾pH 7.5中的葡萄糖氧化酶（20 mg / ml）（储存在-20 °C ）

参考染料溶液
水中的10至20 mM 溶液（在4 °C下储存）

苄基紫精或甲基紫精
水中的苄基紫精或甲基紫精的终浓度为1 0 mM

Acknowledg 发言：

我们实验室的研究得到了美国国立卫生研究院RO1 GM61606的资助。退伍军人事务研究部高级职业科学家奖＃1K6BX004215也支持GC。如Maklashina 等人所述，该方案改编自Vincent Massey（Massey，1991 ）的方法。（2018 ）和氧化还原计算改编自Efimov 等。（2014年）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

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埃菲莫夫（Efimov ，I.），帕金（G.Parkin），米勒（Millett），ES，格兰德（J.Glenday ），陈（Chan），CK ，韦顿（Weedon），H。，兰德哈瓦（Randhawa），H 。一种确定血红素蛋白还原电位的简单方法。FEBS Lett 588（5）：701-704。
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