材料和试剂

1. 0.2 ml PCR管

2. 移液器技巧

3. 5 × Super Script IV缓冲区（Invitrogen）

4. DTT（Invitrogen）

5. 磁珠® 的Oligo（DT ）25（热Fisher Scientific公司）

6. 总RNA

7. 随机引物（N）6 （TaKaRa ）。

8. DNTP（每个25 MM ）（Promega ）

9. SuperScript IV（Invitrogen）

10. 放线菌素D（1,000 Ng / Myu L ）（Nacalai Tesque ）

11. AMPure XP（贝克曼库尔特）

12. 乙醇

13. 核酸酶- 自由水

14. 10×蓝色缓冲液（酶）

15. R Nase H（酶）

16. DNA聚合酶I（酶）

17. KAPA Hyper准备套件（KAPA Biosystems）

18. Tris-HCl

19. 氯化锂

20. EDTA

21. DNA糖基化酶（UDG）（酶）

22. KAPA HiFi HotStart ReadyMix （2×）（KAPA Biosystems）

23. KAPA库定量试剂盒Illumina（KAPA Biosystems）

24. 安捷伦高灵敏度DNA试剂盒（安捷伦科技公司）

25.2 ×绑定缓冲区（请参阅食谱）

26. 洗涤缓冲液（请参阅食谱）

设备

MagnaStand YS模型（FastGene ）
Agilent 2100 生物分析仪（安捷伦科技公司）
定量PCR仪
吸管
热循环仪

程序

在这个协议中，我们使用MagnaStand YS-模型（FastGen ê 在核苷酸酸纯化）与磁性beads.All 实验在0.2ml PCR管中进行。反应方案应该是混合通过轻敲或inversion.All 操作小号应该下一个进行无DNA / RNA的环境。该协议的概述如图1所示。

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1图。该协议流程图此协议。在一个Pproximate 时间要求，显示了每个步骤。

mRNA纯化
洗15 MYU 大号中的Dynabeads ® 寡（DT ）25（热费舍尔小号系统求解）两次，每次用50 Myu L Of 2×结合缓冲液（方案1）使用Magna Stand制备0.2 Ml PCR管（FastGene ），然后将微珠重悬于30 Myu L 的2×结合缓冲液中，以备后用。
“洗涤”表示：

穿上一个磁铁，5分钟，收集除去。
加入2×结合缓冲液并通过移液混合。
再说一次。
Ť变性Otal RNA（超过1 Myug 和RIN> 7.0建议）在30ml MYU 大号的蒸馏水或者10米MM 的Tris·HCl的（PH 8.5）在65℃下2分钟，并然后立即转移Ø ñ 为了冰。一个的L1 热控程序在这个协议可以处理在热循环仪。然后加入30 MYU 大号对洗过的磁珠® 的Oligo（DT ）25 。混合牛逼他混好了，通过移液和孵化在ř OOM温度10分钟。而接下来洗牛逼他混合物70 MYU 大号中洗涤缓冲液（配方2）两次使用的麦格纳立场。
“洗涤”表示：

穿上一个磁铁，5分钟，收集除去。
加入洗涤缓冲液并通过移液混合。
再说一次。
Ť洗脱他RNA在30 MYU 大号预温热蒸馏水80℃5分钟，并然后立即冰上冷却。对于第二轮的PolyA -Selection，添加30 MYU 大号中2 × 结合缓冲液至溶液中，然后在室温下孵育10分钟，再用Magna Stand 用70 Myu L 的洗涤缓冲液两次洗涤混合物，在80°C的14 Myu L 预热蒸馏水中洗脱RNA 2分钟，然后的Plac立即Ë 上的磁体和收集在新的管。该预期量的产品是13 MYU 大号，与在下面的实验可能只进行两次最多。

RNA- seq 文库的制备和测序
混合5 MYU 大号纯化mRNA获得在上面的部分具有4 MYU 大号5×超级脚本IV缓冲液（Invitrogen）和1 MYU 大号冷冻库存100 MM DTT（Invitrogen）中。
的mRNA 是通过分段孵育在94℃进行4.5分钟，然后立即凉编在冰上。
然后添加0.6 MYU 大号100 MyuM 随机引物（N ）6 （TaKaRa公司）和0.9 MYU 大号蒸馏水要的碎片MRNA 。卷的混合物12 MYU 大号。
将其在50°C下孵育5分钟，然后立即在冰上冷却以放松M RNA 的二级结构。
添加逆转录主混合物（1 亩升100的冷冻原液毫DTT，0.4 亩升的dNTPs（25 毫摩尔的每个）（Promega公司），0.1 亩升的的SuperScript IV（Invitrogen公司），0.2 亩升的放线菌素d （千NG / MYU 大号）（ナTesque公司）和5.9 MYU 大号蒸馏的水）。现在牛逼他卷的搭配是20 MYU 大号。
用于逆转录步骤，孵育该混合物在25℃下10分钟，接着用10分钟，在50℃下失活的SuperScript IV通过加热将混合物在80℃下15分钟。然后加入24 MYU 大号中AMPure XP（ Coulter Beckman）和99.5 Pasento EtOH的12 Myu L ，并根据制造商手册执行纯化步骤。
该协议中使用AMPure XP珠子进行纯化的细节如下：

通过移液混合。
室温5分钟。
戴上磁铁5分钟，除去总量。
在磁座上加入70 µl 70％的乙醇并取出。再次重复此步骤。
干涸为1分钟。
加入10.0 µl或其他无核仁水，通过移液混合。
室温1分钟。
穿上磁铁，收集10.0微升或其他上清液384 - 孔PCR板。
洗脱Ť 他转录产物用10 MYU 大号蒸馏水。中混合Ť 他纯化的DNA / RNA杂交解决方案，而珠随着该第二链合成主混合物[ 2 MYU 大号10×蓝色缓冲液（Enzymatics ），1 MYU 大号中的dUTP / NTP混合物（Fermentas公司），0.5 亩升100的冷冻原液毫DTT，0.5 亩升RNA酶H（的Enzymatics ），1 亩升DNA聚合酶I（Enzymatics ）和5 微米升蒸馏水] 的最终的体积混合真实姿态是20 MYU 大号。
孵育Ť 他混合物在16℃下对于4 H. 净化的dsDNA 随着24 MYU 大号中AMPure XP根据制造商的手册。洗脱Ť 他纯化双链DNA用10 MYU 大号蒸馏水。使用5 MYU 大号的双链DNA解为接下来的步骤。
根据制造商手册，使用KAPA Hyper P Rep试剂盒（KAPA Biosystems）以1/10×体积的溶液进行E Nd修复，A尾部和适配器连接，使用1 Myu L 的0.1 Myu M Y型适配器（配方3，长野等人。，2015）在适配器连接步骤和温育15分钟，阿Ť 20 ℃下。最终体积该反应产物是11 MYU 大号。
执行小号我泽选择结扎产品采用5.5 Myueru 中AMPure XP，导致0.32 × AMPure XP。第一大小选择中进行比第二受强粘性连接反应混合液。较小的比例洗脱牛逼他纯化使用10双链DNA MYU 大号的蒸馏水。贯彻牛逼，他第二轮尺寸选择用10 MYU 大号中AMPure XP，导致0.5 × AMPure XP。洗脱牛逼他尺寸选择结扎产品采用15 MYU 大号10 MM 三-的HCl ，PH 8.0。添加1 MYU 大号尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）（Enzymatics ）的大小，选定的连接产物。的混合的体积为16 MYU 大号。
将混合物在37°C下孵育30分钟，以排除第二链DNA。
用于文库扩增，中号九2 MYU 大号的UDG消化的DNA 用1 MYU 大号2.5 MYU 中号索引引物（ShieieijishieijieieijieishijijishieitieishijieijieitiEkkusuEkkusuEkkusuEkkusuXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGT，XXXXXXXX表示索引序列中的补充文件）（长野等人，2015），1 MYU 大号中10 MYU 中号通用引物（EieitijieitieishijijishijieishishieishishijieijieitishitieishieishitishititiTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT）（长野等人。，2015），0.5 MYU 大号蒸馏水和5 MYU 大号中KAPA 高保真的HotStart 预拌（2×）（KAPA Biosystems）中。该卷的混合物10 MYU 大号。
AMPLIFY DNA片段与所述适配器和使用热循环仪具有以下程序索引序列：变性94℃2分钟，在98℃下18个循环持续10秒，65℃30秒，72℃30 S作为扩增步骤，和72℃5分钟的最后延伸。然后执行Ť 禾轮尺寸选择要删除适配器二聚体的等体积的AMPure XP到库解具Myueru 10 DW进行洗脱。接着牛逼洗脱他纯净库10 MYU 大号蒸馏水。现在，你可以游泳池的图书馆，如果需要的话。也可以使用图书馆定量试剂盒（ē .G 。，KAPA文库定量试剂盒Illumina公司（KAPA生物系统公司））确定浓缩后通过合并。
拿出1 MYU 大号的纯化图书馆供选Rophoresis使用安捷伦高灵敏度DNA试剂盒（Agilent技术）来评估质量。典型的浓度库超过1纳克/ MYU L，并且大小分布如下所示（图URE 2）。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1902970--1419鹿岛诚554819 \ Figs jpg \ Fig2.jpg

2图。该方案最终产品的典型尺寸分布，这是使用安捷伦高灵敏度DNA试剂盒进行电泳得到的结果。

菜谱

2 x结合缓冲液
40 mM的Tris-HCl ，pH 7.6

2 M 氯化锂

4 毫米EDTA

洗涤缓冲液
10 mM的Tris-HCl ，pH 7.6

0.15 M 氯化锂

1 毫米EDTA

Y型适配器
100 mM 适配器的混合物（5'-A * \ A * TGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT * C * T-3'5'-/ 5Phos / -G * A * TCGGAAGAGCACGTCTGAACTCCAGTC * A * C-3'。

*表示磷酸硫代磷酸酯键。/5Phos/表示磷酸化）使用热循环仪通过以下程序进行退火：

。95°C 2分钟，缓慢冷却至25°C（0.1°C / S），接着在25°C 30 分钟，将退火后的适配器（50 MyuM ）用DW 稀释成0.1 Myu M，并保存在- 20°C。

致谢

这项工作得到了 JST CREST JPMJCR15O2到AJN。此协议是根据长野等人（2015年）中描述的方法修改的。

利益争夺

我们没有利益冲突或利益冲突。

参考文献

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