材料和试剂

纸巾和丁腈实验室手套
防水记号笔
实验大鼠（3个月大；体重在200至240克之间）
但是，不同年龄的个体可以用于发育或衰老过程的研究。将大鼠以每笼4只的一组饲养，并保持在温度受控（22±2°C）和湿度（45-65％）的环境中。这些动物有一个12-12小时的明暗循环，并随意提供食物和水。

卫康消毒剂® S（拜耳）（用于清洗目的）
卫可® S是一种消毒剂，其中主成分（49.4％）是钾的三聚盐：单过氧硫酸盐，硫酸氢钾和硫酸钾。它还包含18％的六磷酸钠，15％的十二烷基苯磺酸钠，10％的苹果酸和5％的氨基磺酸。

设备

首页笼（Tecniplast © （意大利），1500U Eurostandard IV型）
夜视摄像机（BCS-THC3400IR-E，HD-CVI 4MPX IR 30M）
广角红外（IR）照明器（IR Lab Ltd.，型号：LIR-CS32-940）
大鼠转运蛋白
一种由不透明材料制成的设备，用于将动物从家笼中移到测试场所（图1）。在我们的实验中，我们使用了由两个重叠的硬质PVC管构成的定制运输器。提起中管（用细绳）会露出在外管中切出的入口。它用于标准化程序并确保实验过程中人为操作造成的最小压力水平。运输车应配备上拉门/闸门。在整个试验过程中，必须将门保持打开状态，以允许（但不能强迫）动物离开运输工具或留在运输工具中。然而，应当注意，可以应用任何其他类似的解决方案。

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图1.实验中使用的圆柱形转运子

注意：出口（70 mm x 120 mm）应与测试场地的入口尺寸相匹配。

测量探索行为的箱（图2）
该测试场是一个大盒子（宽度= 800毫米，高度= 800毫米，深度= 600毫米）。腔室分为三个区域（A，B和C），这些区域由垂直于其较长侧延伸的两壁分隔。腔室的前部和顶部由透明壁制成，可以将其抬起以完全进入测试区域。区域之间的木制分隔壁在底部具有三角形的入口（120毫米x 140毫米），这使动物可以在室内部分之间自由移动。分隔线应倾斜放置，以防止视频记录从顶部到正面出现盲点。腔室的入口位于中央区域（A）。其余区域B和C是放置允许进行实验操作的对象的位置。在我们最近的研究中（例如，Pisula 等人，2019），我们为此目的使用了木制隧道（长= 240毫米，宽= 120毫米，高= 80毫米）。整个腔室覆盖有一层可清洗的清漆。木制隧道上覆盖着可清洗的油漆。

Tunne ls（图2）
与最常用的二维实验设置相反，这些隧道提供了复杂的三维环境。在我们的实验中，我们使用了覆盖有可洗漆的硬木制成的隧道（200毫米x 120毫米x 80毫米）。通道放置在区域B和C中。在第一次测试之前，在一个腔室区域中更改了通道的配置，此更改将实验计划引入了新颖性。可以通过手动移动隧道或在腔室的两个区域中添加/减去隧道来更改隧道配置。

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图2.用于测量大鼠和其他小型哺乳动物中的自由探索和对低压力新奇的反应的腔室。通过透明的前墙的正面视图。

软件

BORIS事件记录软件（Friard 和Gamba ，2016；http：//www.boris.unito.it/），用于对记录的材料中的行为进行编码，或任何其他基于视频记录进行行为编码的软件

程序

该实验包括七个习惯性试验，然后是三个涉及实验操作的试验（参见视频1和2）。通过引入新颖性来实现实验操作，这种新颖性发生在试验7和试验8之间。采用这种新布置，在室内进行了三个后续试验（参见视频2）。每个试验持续7分钟，每天对每只动物给药一次。

视频1.习惯性试验示例

视频2.测试示例

制备
实验前，请与人类接触以熟悉动物。
注意：由于整个过程应确保尽可能降低压力水平，因此强烈建议实验人员系统地处理动物。一个典型的程序包括每周3次，每次5-15分钟，包括牵着动物，挠痒痒，与动物交谈等。

用防水记号笔在大鼠的尾巴上做标记，以快速识别笼中的动物，并避免在测试前承受较高的压力。
安排实验设置，如图3所示。

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图3.实验设置的侧视图

根据实验规程将物体放在实验室中（参见图4）。

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图4.习惯化和测试试验期间的测试场地布置。Pisula 等人，2019年以前使用的基本实验计划的示例。

将背景噪声降至最低（或者，可以使用“白噪声”）。
确保在测试环境中完全黑暗。
确保在VR中可以清楚地看到整个测试区域（水平和垂直平面），并且正确放置了IR灯，并通过透明的透明顶盖均匀地照射整个水平表面上的光线。
在实验之前和每次实验之后，请确保已使用清洁剂清洁了整个测试区域（请参见上面的“材料和试剂”）。
每天在同一时间运行测试。

实验程序
从家笼中取出动物，然后将其轻轻地放在运输车中。
锁定运输车。
将运输器放置在连接到测试场所的初始位置（请参见图3）。
让动物保持原状15-20秒以适应环境。
打开运输门。让动物离开运输车或留在运输车中。
注意：在整个试验过程中，门应保持打开状态。

离开实验室。
记录7分钟后，进入实验室，将动物轻轻地从试验场上带走（重要的是不要将厌恶刺激与研究过程中的任何内容联系在一起）并将其放在临时的笼中。
注意：由于动物互动可能产生混淆作用，应将“试验后”临时笼放在另一个房间中。这应该防止等待测量的动物与已经完成测试的个体之间的相互作用。

彻底清洁测试场地和运输车。
确保正确放置腔室内的物体，即按照给定试验的实验方案进行放置（请参见图4）。
每天重复此过程10天。
注意：在进行了第七次习惯性试验后，根据给定试验的实验方案，更改物体在其中一个腔室区域中的布置（请参见图4）。

数据分析

使用事件记录软件，根据记录的资料对行为进行编码。这种软件可以定义特定的行为，并对选定行为的时间和频率进行评分。
对在整个实验过程中发生的选定行为进行评分。个别行为的确切时间，发生频率，以及因此而花费在进行给定行为上的总时间都被指定了特定分数。
所测量的行为包括以下内容：在腔室的不变区域中花费的总时间；在室的更改区域中花费的总时间；在处理室未改变的区域中与隧道接触所花费的时间（爬上隧道，进入隧道内部，与前肢接触，鼻子在距离隧道小于1厘米的距离内工作）；在腔室未改变区域内与隧道接触的频率；与房间更改区域中的隧道接触所花费的总时间；在密室变化区域中与隧道的接触频率；和在腔室区域之间移动的频率。表1列出了为BORIS编码软件准备的表象图。

表1.为Pisula 等人的目的准备的民族志。（2019）研究，由BORIS软件使用

行为代码

行为类型

描述

潜伏

状态事件开/关

从开门到开箱的那一刻计算的离开运输机的等待时间

左区

状态事件开/关

在左侧区域花费的时间（至少该区域的头部和前爪）

右区

状态事件开/关

在正确区域中花费的时间（至少该区域中的头部和前爪）

InsideTransporter

状态事件开/关

在运输车上花费的时间，整个身体，除了尾巴

左隧道

状态事件开/关

与左侧区域的隧道接触所花费的时间

右隧道

状态事件开/关

在正确区域接触隧道所花费的时间

修饰

状态事件开/关

修饰

实验室的设计允许实验人员测量物体嗅探，上部嗅探，饲养，攀爬墙等的时间和频率，以分析特定的探索行为。
要评估动物的情绪状态，请测量离开转运蛋白的潜伏期；拜访运输者的时间和频率，以及修饰的时间和频率。在大鼠的行为研究中，修饰被认为是应激反应量度的一种行为表现（van Erp 等，1994； Thor 等，1988； Komorowska和Pisula ，2003）。
采用多因素分析，重复测量，然后进行LSD 事后测试，并对多个比较进行适当校正（例如Bonferroni）。

笔记

低压力程序要求在声音，照明和空调方面精心准备实验室。
该协议需要一个习惯化阶段，该阶段比其他行为研究中常用的阶段更长。根据我们以前的研究经验，我们建议习惯化阶段应每天重复7天（每天进行一次7分钟的试验）。对许多大鼠品系和实验室短尾负鼠的行为进行的分析，使我们确信，动物在完成此习性计划后即可完全熟悉测试环境。
在实验的测试阶段，请测量在修改了对象配置的区域中动物的活动。重复测试程序至少三遍。这样就可以在习惯和测试试验之间进行重复的度量分析。因此，实验的标准计划将包括七个习惯化试验和三个涉及实验操作的试验。
为避免偏侧化或视觉/听觉提示的混淆效果，应将一半的受检大鼠的右室区引入新颖性，将其余一半引入左室区的新颖性（例如，右半部分的镜像）图4）。
重要提示：如果在实验的适应阶段，任何动物的右或左区偏向度/偏好度过高，我们强烈建议将该动物排除在后续试验之外。

用于测量自由（低应力）勘探的本协议可以以各种形式和变体使用。根据研究问题，实验者可能更喜欢使用新型刺激的视觉，嗅觉或触觉特征。实验室可以很容易地调节以达到这些目的。放置在腔室区域中的物体可以被操纵，以减少和增加环境复杂性或改变新刺激的性质。
实验计划主要基于重复测量。此特性带来许多好处，但同时也设置了一些要求。首先，标记低压力个体以正确编码连续的测量值至关重要。其次，统计方法需要适合于涉及对象内效应（重复测量）和对象间分析（各种操作）的分析。

致谢

该协议的初始版本应用于RHA / RLA大鼠的研究（Pisula ，2003年）。最新版本和最新应用已在对李斯特（Lister）带帽大鼠的研究中描述（Pisula 等，2019）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

建议实验人员遵守有关动物实验的当地道德要求。必须注意，该协议本身不涉及任何有害或痛苦因素。因此，在许多国家/地区，获得道德许可不是强制性的。但是，可能对动物造成压力的刺激的引入可能导致这种必要性的出现。

参考文献

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Friard ，O.和Gamba ，M.（2016）。BORIS：一个免费的，多功能的开源事件记录软件，用于视频/音频编码和实时观察。方法Ecol Evol 7（11）：1325-1330。
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