材料和试剂

不锈钢镊子（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：DS0399-0001）
移液器（分别为Eppendorf，P1000，目录号：3120000062； P200，目录号：3120000054； P10，目录号：3120000020； P2.5，目录号：3120000011）
烧瓶（Duran，50 ml，目录号：21-216-17; 100 ml，目录号：21-216-24）
细胞培养皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，Nunc TM EasYDish TM ，目录号：150466）
1.5 ml微管（Axygen ®，目录号：MCT-150-C）
试管（Eppendorf，15 ml，目录号：0030122151; 50 ml，目录号：0030122178）
细胞刮板机（Costar，目录号：3010）
移液器吸头（Eppendorf，1,000 µl，目录号：0030000919; 200 µl，目录号：0030000870; 10 µl，目录号：0030000811）
铝箔
封口膜
菌株（白色念珠菌，SC5314）（ATCC，目录号：10231）
酵母提取物（BD Biosciences，目录号：212750）
蛋白ept（BD Biosciences，目录号：211677）
葡萄糖（BD Biosciences，目录号：215530）
琼脂（BD Biosciences，目录号：214040）
RPMI 1640培养基（Sigma-Aldrich，目录号：R6504）
一水磷酸钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：S369-500）
无水磷酸氢二钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：BP332-500）
氯化钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：S671-3）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：59223C）
蒸馏水
2-（N-Morpholino）乙烷磺酸（MES）（Sigma-Aldrich，目录号：M5287）
三氯乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：T9159）
冰
液氮
YPD培养基
醚（国家药业化学试剂有限公司，目录号：10009318）
cAMP酶免疫分析试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：CA200）
1. 山羊抗兔IgG包被96孔
2. cAMP碱性磷酸酶结合物
3. cAMP EIA抗体兔抗cAMP
4. 0.1 M盐酸
5. 水中0.1 M HCl
6. 中和试剂
7. 洗涤缓冲液浓缩液
8. 循环AMP标准
9. p -磷酸硝基苯酯底物溶液
10. 停止解决方案
11. 三乙胺
12. 醋酸酐
13. 封口机
MES缓冲液（请参阅配方）
Sabouraud葡萄糖琼脂培养基（SDA）（请参阅食谱）
YPD汤（请参阅食谱）
YPD琼脂培养基（请参见食谱）
1x PBS（请参阅食谱）

设备

超声波细胞破碎机（Celton，型号：UH-500B）
30°C摇动培养箱（Infors，型号：Multitron Standard）
CO 2 培养箱（ESCO，CelMate ®，型号：CLM-170B-8-NF）
多孔板振荡器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，Sorvall TM ST 40R，目录号：75004524）
多模式酶标仪（分子仪器，SpectraMax M5）
高压灭菌器
离心机

程序

白色念珠菌的生长和生物膜形成
1. 在35°C下于Sabouraud葡萄糖琼脂培养基上传代白色念珠菌。
2. 选择一个菌落，并在振荡培养箱（200 rpm）中于30°C接种10 ml YPD培养基。过夜生长。
3. 离心培养物（2,100 x g ，10分钟），弃去上清液。用10 ml的1x PBS洗涤细胞，将细胞在2,100 x g 下离心5分钟，弃去上清液，重复两次。然后，丢弃上清液并收获细胞。
4. 将细胞重新悬浮，并在RPMI 1640培养基（每个细胞培养皿中使用10 ml RPMI 1640培养基）中，将其在600 nm（OD 600nm ）处的光密度稀释为0.4。
5. 将悬浮液在37°C的温度下接种到细胞培养皿中，不要摇晃（接种物应铺开以覆盖培养皿的整个底部）。2小时后，轻轻取出接种物（避免刮擦新形成的生物膜），用5毫升1x PBS洗涤两次以除去未粘附的细胞。向每个培养皿中加入10 ml新鲜的RPMI 1640培养基。然后，在37°C下孵育而不摇动以形成生物膜。
处理生物膜细胞样品
1. 从培养皿中取出培养基，并用2 ml蒸馏水轻轻冲洗生物膜（使用移液器缓慢添加蒸馏水，以免干扰生物膜）。向培养皿中加入1毫升蒸馏水，刮去培养皿以分离生物膜，然后将样品添加至15毫升试管中。然后重复此过程，添加1毫升蒸馏水以收集剩余的样品。
2. 在室温下以2,100 x g 离心样品5分钟，并弃去上清液。加入1 ml MES缓冲液，并将样品转移至1.5 ml微管中，以2,100 x g 的速度离心样品5分钟，弃去上清液。
3. 然后，将样品在干燥器中干燥，加入10％三氯乙酸（不超过MES缓冲液的一半体积），在此加入0.5 ml。
4. 在液氮中冷冻样品，然后在冰上解冻样品，重复此过程两次。使用超声波破碎机在冷藏条件下进行超声处理（两次在130 W下进行2分钟）。
5. 加入1 ml饱和水的乙醚，在室温下以600 x g 离心5分钟，弃去上清液。重复四次以确保提取了三氯乙酸。
测量细胞内cAMP含量（表1）
注意：cAMP含量是根据制造商的说明使用cAMP酶免疫测定系统测量的。在打开之前，让所有试剂至少加热到室温至少30分钟，并且不要使用聚苯乙烯管。

表1.细胞内cAMP含量的测量程序
1. 将0.5 ml的乙酸酐添加到1 ml的三乙胺中以制备乙酰化试剂。用90 ml蒸馏水稀释10 ml Wash Buffer浓缩液以制备1x Wash Buffer。
2. 准备cAMP标准解决方案：
  1. 将五个12 x 75毫米的管从1贴到5。
  2. 在管1中加入990 µl 1 M HCl，在管2-5中加入750 µl。向试管1中加入10 µl循环AMP标准液并充分混合。
  3. 然后，将250 µl溶液从试管1转移到试管2。将cAMP从试管2稀释到试管5串联。管1至5中的cAMP浓度分别为20、5、1.25、0.312和0.078 pmol / ml（表2）。
  4. 将一根12 x 75 mm管标记为零标准/ NSB管。
    
    表2. cAMP标准溶液的制备
3. 将50 µl中和试剂添加到ELISA板的每个孔中，但孔A1-D1除外（图1）。分别向孔E1-H1中加入100 µl 0.1 M HCl。将100 µl标准溶液1-5加入A2-B3孔中。
4. 将100 µl样品加到适当的孔中。
5. 将50 µl 0.1 M HCl加入E1-F1孔（NSB孔，非特异性结合孔）中。
6. 除A1-D1孔外，向每个孔中加入50 µl蓝色cAMP-碱性磷酸酶缀合物。向除A1-F1以外的所有孔中添加50 µl黄色cAMP EIA抗体（图1）。
  
  图1. cAMP测量的板布局
7. 在平板振荡器上（500 rpm）在室温下孵育平板2小时。
8. 清空孔中的内容物，并使用1x洗涤缓冲液洗涤每个孔。重复两次并丢弃剩余的洗涤缓冲液。
9. 向TA孔中加入50 µl蓝色的cAMP-碱性磷酸酶结合物。向每个孔中添加200μl的 p -磷酸硝基苯酯底物溶液。
10. 将板在室温下孵育1小时而不摇动。
11. 向每个孔中添加50 µl终止溶液。读取405 nm处的光密度（OD），最好在570至590 nm之间进行校正。

数据分析

计算cAMP的浓度如下（表3）：

计算每个标准品和样品的平均净光密度（OD）：
平均净OD =平均边界OD –平均NSB OD
计算每对标准孔的结合量（以最大结合孔（Bo）的百分比）：
结合百分比=净OD /净Bo OD x 100
使用Logit-Log纸质图的cAMP的百分比绑定与浓度作图，并通过这些点画一条直线。然后，通过内插法确定cAMP的浓度。

表3.计算cAMP浓度的典型结果

对于每个测定，一式三份地重复测试，并在不同的日子一式三份地测试每个组。

菜谱

MES缓冲液（1 L）
21.3 g MES
5 M NaOH（将pH调整至6.0）
1升蒸馏水
高压釜（120°C，120 kPa持续20分钟）
SDA琼脂培养基（1 L）
10克蛋白<
40克葡萄糖
20克琼脂（2％）
1升蒸馏水
高压灭菌器（120°C，120 kPa持续20分钟）
YPD汤（1升）
10克酵母提取物（1％）
20克蛋白ept（2％）
20克葡萄糖（2％）
1升蒸馏水
高压灭菌器（120°C，120 kPa持续20分钟）
YPD琼脂培养基（1 L）
10克酵母提取物（1％）
20克蛋白ept（2％）
20克葡萄糖（2％）
20克琼脂（2％）
1升蒸馏水
高压灭菌器（120°C，120 kPa持续20分钟）
1x PBS
2.62 g一水磷酸二氢钠
11.5克无水磷酸氢二钠
43.84 g氯化钠
500毫升蒸馏水
将pH调整至7.2（1 M NaOH）
高压釜（120°C，120 kPa持续20分钟）

致谢

该协议改编自我们先前发布的工作（Chen et al。，2018）。这项工作得到了国家自然科学基金项目的资助，资助号为81970945和81371156，并获得了江苏省高等学校优先学术计划发展基金会的资助（PAPD，2018-87）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突或利益冲突。

参考文献

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